2018 Fiscal Year Research-status Report
シャーガス病の創薬標的探索に資する遺伝子改変手法の開発
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18K15141
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| Research Institution | National Institute of Advanced Industrial Science and Technology |
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Principal Investigator |
高木 悠友子 国立研究開発法人産業技術総合研究所, 生命工学領域, 研究員 (50783669)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 感染症 / 創薬標的 / 遺伝子組換え / ゲノム編集 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
近年、CRISPR/Cas9の活用によりトリパノソーマ原虫においても遺伝子ノックアウトが簡便に行えるようになってきた。トリパノソーマには化学的トランスフェクション試薬が有効でないため、エレクトロポレーションによる核酸導入が現状唯一のgRNA導入手法として使われている。しかし、致死性のノックアウトが発動した場合はそれ以上原虫が増えないため、スケールアップが難しいエレクトロポレーションでは分子生物学的な解析のための大量のサンプルを回収できないという問題がある。また、宿主細胞内に寄生する原虫には直接gRNAを導入できないという問題もあった。そのため、大量に原虫を増殖させた後、あるいは原虫を宿主に寄生させた後にCas9発現を誘導できるノックアウトシステムを確立することが解決策として考えられる。
2018年度は、まず既存のノックアウト手法を利用し、モデル遺伝子として使用できる必須遺伝子を選定した。また、当初予定していたアプローチではないが、宿主寄生ステージの原虫を一定期間宿主外で培養できる条件を発見し、これにより宿主感染ステージの原虫において標的遺伝子の必須性を確認することができるようになった。
Cas9発現を誘導するノックアウトシステムの構築については、tetリプレッサーによるon/off制御を試みた。tetリプレッサーやT7 RNA polemeraseをプラズミドで導入した原虫を作製し、テトラサイクリンによるGFPシグナルの誘導を観察したところ、制御の精度は原虫による個体差が激しいことが判明した。そのため、作製した原虫株のクローン化などの対策が必要であると考えられる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
Cas9発現を誘導するノックアウトシステムの構築については、原虫間の個体差が激しく、当初予定していたようなon/off制御を行うところまでは到達していない。しかし、宿主細胞内に寄生する原虫に直接gRNAを導入できなかった問題を、当初の予定にはない方法で解決することに成功した。このため、全体としてはおおむね順調に進展していると考える。
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| Strategy for Future Research Activity |
原虫の個体差が新たに課題として浮上したことを踏まえ、構築した株のクローン化を試みる。また、宿主細胞内ステージにおいて原虫のノックアウトが可能になったことから、一次スクリーニングで得られた必須遺伝子が原虫の全感染ステージで必須であるかを検証し、真のドラッグターゲットとなる遺伝子を選定する。
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| Causes of Carryover |
tet誘導株の作製に関して当初の想定にはなかった問題が浮上し、それに関連する実験が予定より遅れているため次年度使用額が生じた。問題が解消され次第、合成核酸など関連試薬の購入に充てる。
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