2018 Fiscal Year Research-status Report
ヘリコバクター・ピロリCagAタンパク質の発がん活性を規定する分子構造基盤
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18K15155
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| Research Institution | High Energy Accelerator Research Organization |
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Principal Investigator |
長瀬 里沙 大学共同利用機関法人高エネルギー加速器研究機構, 物質構造科学研究所, 研究員 (60768034)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | ピロリ菌 / CagA |
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| Outline of Annual Research Achievements |
近年の研究からピロリ菌cagA遺伝子陽性株感染と胃がんとの密接な関連が明らかとなり、胃がん発症機序への理解や胃がん治療への応用にCagAの発がん活性発現における分子機構の解明が重要な意義を持つものと期待されている。これまでに、CagAを介する胃がんの発症においてCagA-SHP2複合体形成によるSHP2チロシンホスファターゼの機能的脱制御が重要な役割を果たすことが示されている。本研究ではX線結晶構造解析によりCagA-SHP2複合体の立体構造を解析することで、CagAによるSHP2活性化の分子基盤を解明することを目的としている。
本年度は研究実施計画として初めに予定していたチロシンリン酸化CagAペプチド-SHP2複合体の結晶構造解析を行なった。まず、EPIYA-Dペプチド-SHP2複合体の結晶化スクリーニングから開始した。嫌気チャンバー内でのスクリーニングの結果、結晶が得られる条件が見つかったが、得られた結晶は非常に脆くX線回折実験に用いることができなかった。また、結晶化の再現性が非常に低く、安定的に結晶が得られる条件は見つかっていない。そこで、CagAの別の宿主細胞内標的分子であるPAR1キナーゼを加えたCagA-SHP2-PAR1三者複合体を形成させることでCagA-SHP2間の結合が安定化するということが示唆されていたため、次に、当初の計画を変更してCagAのEPIYA-DセグメントならびにCagAのPAR1結合部位であるCM配列を模したペプチド(EPIYA-D-CMペプチド)とSHP2およびPAR1との三者複合体の結晶化に着手した。この複合体を用いて結晶化スクリーニングを行なったが、複合体の結晶は得られていない。今後は、EPIYA-Dペプチド-SHP2複合体およびEPIYA-D-CMペプチド-SHP2-PAR1複合体の安定性解析を開始する予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
当初の計画では初年度までにX線回折実験を行う予定であったが、現時点では結晶化条件のスクリーニングを行っている段階である。しかし、回折実験に用いるには質的に不十分ではあるが、結晶が得られる結晶化条件が見つかっているため、その条件を基に結晶化条件の最適化を行うことで回折データを収集できる結晶が得られると考えている。以上のように当初の計画からは多少の遅れがあるが、結晶が得られる条件の決定が本研究における最も大きな障壁であると考えられるため、現状としては大きな遅れではないと考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後はまず、EPIYA-Dペプチド-SHP2複合体およびEPIYA-D-CMペプチド-SHP2-PAR1複合体の安定性解析を行う。それぞれの複合体がより安定化する条件が決定したら、その条件において結晶化スクリーニングを開始する。複合体の安定性解析と並行してEPIYA-DペプチドとSHP2との複合体の結晶化条件の最適化を行う。結晶化条件が決定した場合、その条件を基に他のCagAペプチドを用いたSHP2とのまたはPAR1を含めた三者での共結晶化を行う。さらに、全長CagAを用いて同様の結晶化条件における結晶化を行う。なお、それぞれの結晶化の際には最初に得られた複合体の結晶を用いたヘテロマイクロシーディングも試みる。結晶が得られた場合には随時X線回折実験を行う。回折データが収集でき次第、各種複合体の結晶構造の決定を目指す。結晶構造解析により立体構造情報が得られた場合、当初の計画通り、CagA-SHP2複合体形成ならびにCagA-SHP2-PAR1複合体形成を阻害するCagA変異体分子の作製および立体構造解析により得られたCagA変異体分子の生物学的機能の解析を開始する。
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| Causes of Carryover |
本年度の研究計画では結晶化から回折データの取得、さらに構造解析を行う予定であった。しかし、現状として結晶化条件のスクリーニングを行っている段階であり、やや遅れが生じている。従って、研究の遅れに伴い本年度使用額が次年度に持ち越された。以上の事由から次年度使用額が発生した。しかし、次年度の早い段階で結晶が得られ、回折データが収集できる見通しである。従って、本年度に計上していた解析用PCも早い段階で購入する予定である。さらに、現段階では１種類のペプチドを用いて結晶化スクリーニングを行っているが、結晶化条件が決定し次第すぐに複数種類のペプチドを購入する予定である。実験の進行に伴い、本年度に使用する予定であった試薬も購入する。それ以降は２年目の研究計画通りに進行すると考えられるため、次年度使用計画に従って使用していく。
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Research Products
(3 results)
