Elucidation of the mechanism by which glycan expression is regulated in intestinal epithelia

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K15187
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 奥村 龍 大阪大学, 医学系研究科, 助教 (00793449)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: 糖転移酵素 / 腸内細菌 / 粘膜バリア

Outline of Annual Research Achievements

平成30年度に小腸上皮で腸内細菌により発現が亢進し、さらに大腸上皮では恒常的に高発現していることが明らかとなったB3galt5とB3gnt7の二つの糖転移酵素に着目し、それらの腸管における機能を解析するために両遺伝子の欠損マウスをCRISPR/Cas9システムを用いて作製した。
B3galt5は1型糖鎖抗原(Galb1-3GlcNAcb1-3-R)の合成活性を有しており、Sialyl-Lewis a抗原の生合成に関与することが報告されている。そのため、小腸、大腸組織におけるSialyl-Lewis a抗原の存在を抗Sialyl-Lewis a抗体を用いた免疫染色により解析したところ、小腸、大腸粘液中にSialyl-Lewis a抗原が含まれることがわかり、さらにB3galt5欠損マウスではその存在が認められないことから、B3galt5はムチンに含まれるSialyl-Lewis a抗原の生合成に関与していると考えられる。今後は粘膜バリアの観点からムチンにおけるSialyl-Lewis a抗原の役割を腸炎モデルや細菌感染モデルを用いて明らかにしていく。
一方でB3gnt7はN-アセチルグルコサミンの転移酵素の一つで、ケラタン硫酸の生合成に関与することが知られている。そのため抗ケラタン硫酸抗体を用いて、大腸組織におけるケラタン硫酸の存在を解析したところ、大腸上皮最上層表面にケラタン硫酸の存在が認められた。今後は同様にケラタン硫酸の生合成に関わる硫酸基転移酵素であるChst4の欠損マウスも作製し、B3gnt7欠損マウスと合わせて小腸、大腸の粘膜バリアにおけるケラタン硫酸の役割について、腸炎モデルや細菌感染モデルを用いて解析を進めていく。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

当初の計画通り、RNA-seq解析により腸内細菌によって腸管上皮で誘導される糖転移酵素が新たに同定でき、またCRISPR/Cas9システムを用いて、同定した糖転移酵素の欠損マウスの作製に成功した。さらにB3galt5欠損マウスの解析により、B3galt5はムチンのSialyl-Lewis a糖鎖付加を担っていることが明らかとなった。以上の結果から、おおむね研究は順調に進展していると考える。
当初予定していた潰瘍性大腸炎（UC）患者の大腸組織における糖転移酵素の発現解析に関してはまだ未実施であるが、最近Cell誌に報告された論文（Smillie CS et al. Cell.25;178(3):714-730.2019）でのUC患者大腸組織のsingle cell RNA-seq解析により、B3galt5、B3gnt7ともにUC患者の腸管上皮で発現が亢進していることが明らかとなった。この理由として、腸管炎症に伴い免疫細胞により産生されたIL-22が両糖転移酵素の発現を亢進させていると考えられる。今後はその結果を踏まえて、日本人のUC患者でも同様の結果が得られるか検討を続けていく。

Strategy for Future Research Activity

ここまでの研究により、小腸で腸内細菌によって誘導され、大腸で恒常的に高発現するB3galt5、B3gnt7の二つの糖転移酵素を同定し、それらの欠損マウスを作製した。今後は、両欠損マウスの腸炎モデルや、Citrobacter rodentium、Salmonella Typhimuriumといった病原性細菌の感染モデルに対する感受性を評価し、両糖転移酵素の腸管粘膜バリアにおける機能を明らかにしていく。
また腸管上皮の糖鎖修飾が変化することで、宿主の糖鎖を栄養源とする腸内細菌もまた変化することが予想される。両糖転移酵素欠損マウスの腸内細菌叢の変化を小腸、大腸内容物の細菌DNAのシークエンシングにより明らかにする。
これまでの結果からB3galt5はムチンのSialyl-Lewis a付加を担うと示唆されるが、B3galt5発現の有無によりムチンの糖鎖構造にどのような変化が起こるか、またムチンの機能にどのような変化が起こるかを、B3galt5欠損マウスより採取したムチン蛋白やムチン遺伝子とB3galt5遺伝子を強制発現させた細胞株より精製したムチン蛋白の機能解析、糖鎖解析を行うことで明らかにしていく。
一方でB3gnt7については、糖蛋白のケラタン硫酸付加に関与すると考えられ、発現の分布からその糖蛋白の候補としてバリア分子の一つであるLypd8が予想される。今後はB3gnt7欠損マウスにおけるLypd8の糖鎖修飾変化ならびに機能変化の解析を進めていく。

Causes of Carryover

ヒト腸管上皮細胞解析に計画変更が生じたため107,797円の繰越金が生じた。翌年度分として請求した助成金と合わせて、B3galt5欠損マウス、B3gnt7欠損マウスの解析費用として充てることを計画している。