2018 Fiscal Year Research-status Report
PD-L1 as target for the development of a new oncolytic virus
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18K15274
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
BUSTOS Itzel 名古屋大学, 国際機構(医), 特任講師 (60788777)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | PD-L1 / oncolytic virus / 免疫チェックポイント阻害剤 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、PD-L1高発現腫瘍への指向性を獲得した新たな腫瘍溶解性ウイルスHF10の開発を目的とする。具体的には、ウイルス表面の糖たんぱく質（glycoprotein B；gB）に抗PD-L1抗体の一本鎖抗体（single chain antibody；scFv）を結合させることで、腫瘍表面のPD-L1を特異的に認識し、腫瘍に感染、破壊するウイルスを作製する。
平成30年度は、抗PD-L1 scFvをウイルス表面に発現する腫瘍溶解性ウイルス（HF10αPD-L1）の構築を遂行した。HF10ゲノムgB遺伝子に抗PD-L1 scFv遺伝子を挿入することを計画した。抗ヒトPD-L1抗体の軽鎖可変領域（VL）と重鎖可変領域（VH）の遺伝子を人工合成し、この抗PD-L1 scFv遺伝子カセットの両端を各500塩基ずつgB遺伝子と同じ塩基配列で挟んだプラスミドベクターを構築した。このベクターと共にHF10ゲノムDNAをVero細胞にトランスフェクションし、相同遺伝子組み換えによりgBに抗PD-L1 scFv遺伝子を組み込むことを計画した。この予備実験として、別の遺伝子座にZsGreen1のみを発現するHF10の構築を試みたが、相同組み換えの効率の低さが問題となった。その対策として、CRISPR/Cas9ゲノム編集技術を用いたところ、相同組換え効率を向上させ得ることが示唆された。今後は、この技術を用いてHF10αPD-L1の開発を進める。
HF10と抗PD-L1抗体とのマウス扁平上皮がん細胞SCC7皮下腫瘍モデルマウスにおける併用療法の検討を行った。その結果、HF10と抗PD-L1抗体併用群は強い抗腫瘍効果を示した。この結果はHF10αPD-L1の強い抗腫瘍効果を期待させる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
抗PD-L1 scFv遺伝子導入用プラスミドの作製は計画通りに行うことができたが、抗PD-L1 scFv遺伝子が安定的にゲノムに挿入された遺伝子改変HF10の構築にやや時間を要している。HF10αPD-L1の作製及びPD-L1発現細胞への指向性、殺細胞効果および増殖能力の検討の確認までは平成30年度内に着手することができなかったため、やや遅れていると評価した。
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| Strategy for Future Research Activity |
HF10αPD-L1の作製を直ちに行い、そのPD-L1発現細胞への指向性、殺細胞効果および増殖能力を検討する。具体的には、PD-L1を強発現または欠損させたマウス膵癌細胞株PAN02およびマウス口腔扁平上皮癌細胞株SCCⅦを用いて、親株PAN02およびSCCⅦと比較し、HF10αPD-L1の増殖能の違いを確認する。HF10又はHF10αPD-L1を1, 0.1, 0.01 MOIでPD-L1強発現または欠損PAN02とSCCⅦ細胞ならびにそれら親株に感染させ、経時的に培養上清中のウイルス力価を測定し、ウイルス増殖能を調べる。さらに各細胞を96 well plateに播き、HF10又はHF10αPD-L1を1, 0.1, 0.01MOIで感染させ、経時的にMTT assayにより細胞の生存率を調べ、殺細胞能力を確認する。
PD-L1の恒常的発現が認められるヒト正常細胞株におけるHF10αPD-L1の増殖能を前述の方法を用いて親株HF10と比較しHF10αPD-L1の安全性の検討を行う。また、ICRマウスに経腹または経尾静脈で感染させ、マウスの生存率を確認する。さらに、マウスの肝臓、肺、心臓などの主要臓器からqPCRを用いてウイルスゲノムDNAを検出し、HF10αPD-L1の生体内分布を調べる。
PD-L1高発現SCCⅦをC3Hマウス皮下に植え、背中に腫瘍を2つ作製し、7 日後、片一方の腫瘍にMock(PBS)またはHF10αPD-L1もしくは親株HF10を注射する（3 日おきに3回）。継時的に腫瘍サイズとマウス体重を測定し、HF10αPD-L1の治療効果を明らかにする。また、効果の検証だけでなく、関連する免疫の変化について詳細に探求する。特にMDSC、マクロファージ、T regマーカーにより腫瘍内の免疫抑制細胞の変化を確認する。
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