Significance of PVT1-MYC chimeric gene in refractory hematological malignancies

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K15281
• Research Institution: Hiroshima University
• Principal Investigator: 名越 久朗 広島大学, 病院(医), 助教 (80713924)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: PVT1 / ノンコーディングRNA / MYC / 難治性造血器腫瘍 / キメラ遺伝子

Outline of Annual Research Achievements

研究期間中、①PVT1-MYC融合遺伝子の機能的意義を解明するために、PVT1-MYC融合遺伝子が発現していないリンパ系造血器腫瘍の細胞株に同融合遺伝子を強制発現させ、その表現型の変化について解析することを進めた。PVT1-MYC融合遺伝子が発現している細胞株と発現していない細胞株を決定するため、悪性リンパ腫(ML)や多発性骨髄腫(MM)の細胞株を用いて融合遺伝子の発現の有無についてreverse-transcription-polymerase chain　reaction(RT-PCR)法を用いて検討しているが、融合遺伝子の発現が非常に微量のためか、安定した結果が得られなかった。昨年度に引き続いてRT-PCRの条件設定(Taqポリメラーゼ、アニーリング温度、伸長反応時間、サイクル数など)を変更し、安定した結果の得られる条件を引き続き検討した。時に確認できる転写産物については、ダイレクトシークエンスによりPVT1のexon 1とMYCのexon 2が融合した塩基配列であることを確認しており、次に強制発現させるための融合遺伝子全長をクローニングするための方法を引き続き検討した。
また、②PVT1-MYC融合遺伝子の臨床的意義を検討するために、患者検体および臨床情報を用いた解析ができるよう、倫理委員会承認の手続きを準備し、当科で加療中の悪性リンパ腫、多発性骨髄腫患者の臨床情報を収集した。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

予備実験では容易にPVT1-MYCキメラ遺伝子が同定できていたが、RT-PCRの結果が安定して得られず、条件設定に苦慮している。また、PVT1-MYCキメラ遺伝子の機能的解析を行うため、キメラ遺伝子を発現していない細胞株に強制発現させる必要があるが、レンチウイルスに導入するキメラ遺伝子の全長をクローニング可能な方法が未定である、次世代シークエンス技術でクローニングをする予定であるが、現在我々が使用可能な方法ではPVT1-MYCの全長をクローニングすることが困難である。他の方法を検討中である。

Strategy for Future Research Activity

安定してキメラ遺伝子が同定できるRT-PCRの条件設定を引き続き行う。条件設定ができれば、倫理委員会の承認を得たのちに、患者検体でPVT1-MYCキメラ遺伝子の発現について解析し、臨床情報とキメラ遺伝子発現との関連について解析を行う。
PVT1-MYCキメラ遺伝子の機能的解析を行うため、融合遺伝子を強制発現させるためのキメラ遺伝子全長をクローニングする方法を検討する。次世代シークエンスを用いてクローニングすることを検討しており、他施設へのコンサルテーションを検討する。

Causes of Carryover

安定した結果が得られるPCR条件設定に苦慮したことや、キメラ遺伝子のクローニングが進まず、研究進捗状況に多大な遅れが生じているため研究費を使用しなかった。キメラ遺伝子のクローニングのため、次世代シークエンシングを行うことや、クローニングした遺伝子をベクターに組み込む実験など、次年度にずれこんだ研究計画に次年度使用額を使用する予定である。