The regulation of off-target insertion of donor DNA in therapeutic genome editing

2019 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 18K15288
• Research Institution: Nagoya University
• Principal Investigator: 新田 洋久 名古屋大学, 生命農学研究科, 研究員 (60808690)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: 遺伝子治療 / ゲノム編集 / 造血幹細胞 / CIRCLE-seq / iCaspase9

Outline of Annual Research Achievements

前年度は、ヒトの造血幹前駆細胞を用いた遺伝子修復治療技術の確立のために、IL2RG遺伝子を標的としたゲノム編集とドナー配列の検証を行なった。その結果としてヒト造血幹前駆細胞への相同組み換えの効率は目標値を達成したため、今年度はゲノム編集によるオフターゲット効果の検証を行った。CIRCLE-seq法を用いてゲノムワイドにオフターゲット領域の検出を行い、UTRN、NEURL1 、ABHD2、TAZなどの遺伝子のイントロン中にオフターゲット領域の候補を検出した。遺伝子機能を欠損させうるオフターゲット領域は検出できなかったため、用いたガイドRNA配列はIL2RG遺伝子ノックアウトマーモセットの遺伝子修復治療に用いることが可能であると確認できた。
遺伝子修復技術の安全性向上のためにドナー配列に自殺遺伝子を組み込み、ドナー配列のオフターゲット挿入が抑制できる可能性を検証した。自殺遺伝子の一つであるiCaspase9遺伝子が組み込みこまれたドナー配列をCRISPRタンパク質と共にK562細胞に導入した。iCaspase9はCIDというダイマライザーを加えると細胞死誘導活性を持つので、薬剤を加えた後に非相同組み換えが起きた細胞の割合をレポーター遺伝子の発現量で測定した。その結果、iCaspase9遺伝子組み込みドナー配列を用いた場合には、非相同組み換えが起こった細胞の割合が低かった。この結果から、iCaspase9遺伝子組み込みドナー配列を用いることにより遺伝子修復の安全性を向上できることが示唆された。