2018 Fiscal Year Research-status Report
CRISPR/Cas9によるHSVtk導入iPS細胞を用いたグリオーマ遺伝子治療
Project/Area Number |
18K15289
|
Research Institution | Keio University |
Principal Investigator |
森本 佑紀奈 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 助教 (10793119)
|
Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
|
Keywords | 悪性神経膠腫 / iPS細胞 / 神経幹細胞 / 自殺遺伝子 / バイスタンダー効果 / HSVtk / ゲノム編集 / CRISPR/Cas9 |
Outline of Annual Research Achievements |
悪性神経膠腫(グリオーマ)は、脳腫瘍幹細胞の存在により、強い浸潤性および治療抵抗性を示す。自殺遺伝子療法は、bystander効果により広範に脳腫瘍幹細胞を死滅させる可能性があるが、申請者らはさらに治療効果を高めるため、脳腫瘍幹細胞へ遊走性を示すinduced pluripotent stem cell (iPS細胞)由来の神経幹細胞(NSC)に自殺遺伝子を導入する新規治療法を開発し、ヒトグリオーマモデルマウスに対して著明な治療効果を証明した。しかし自殺遺伝子のヒトiPS細胞に対する細胞毒性から、恒常的な遺伝子発現が困難であることも明らかになった。そこで、本研究ではまず①自殺遺伝子による細胞毒性を克服するために、iPS細胞のメタボローム代謝解析を行う。次に、②CRISPR/Cas9ゲノム編集技術を用いて、ハウスキーピング遺伝子領域等に自殺遺伝子を挿入したiPS細胞を樹立し、NSCへ分化させ遺伝子を恒常的に安定して発現する治療用NSCを確立し、③グリオーマ細胞根絶のためにbystander効果を増強させることを目的とする。
|
Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
レンチウイルスベクターでヒトiPS細胞にHSVtkを遺伝子導入した細胞株を作製し、メタボローム代謝解析を行い、プリンヌクレオチド及びピリミジンヌクレオチド合成経路を解析した。チミジン(dT)を添加することで、Thymidine kinase (TK)を有する細胞は、デオキシチミジン三リン酸(dTTP)が増加し、リボヌクレオチドレダクターゼ(Ribonucleotide reductase)がフィードバック阻害され、シチジン二リン酸(CDP)から2'-デオキシ シチジン二リン酸(dCDP)が低下し、デオキシシチジン三リン酸(dCTP)のプール枯渇によりDNA合成が阻害され、細胞死が誘導された。以上より、ヒトiPS細胞に対してHSVtkは細胞毒性を有する事がわかり、少なくともNSCに誘導し動物モデルに移植する際にはやはりTet-inducible systemを導入する必要がある。
|
Strategy for Future Research Activity |
上記のメタボローム解析の結果により、HSVtkはヒトiPS細胞に対して細胞毒性を有したため、少なくともHSVtkをiPS細胞に導入しNSCに分化誘導する際には、Tet-inducible systemを用い、ドキシサイクリン非投与下で培養を行う必要がある。予備実験の結果HSVtkのグリオーマ細胞株に対するバイスタンダー効果による抗腫瘍効果は良好であり、導入遺伝子として魅力的な側面もある。しかし、Tet-inducible systemを用いたとしても、レンチウイルスベクターによる遺伝子導入では、染色体にランダムに挿入されるため、挿入部位の遺伝子変異や周辺遺伝子の活性化、位置効果による自殺遺伝子の不活性化が懸念される。そこで本年度は、CRISPR/Cas9ゲノム編集技術を用いて、ハウスキーピング遺伝子やセーフ・ハーバー領域等に自殺遺伝子HSVtkもしくはTet inducible-HSVtkを挿入したiPS細胞を樹立し、NSCへ分化させ遺伝子をより安定して発現する治療用NSCを確立する。その後、in vitro及びin vivoで抗腫瘍効果を比較検討する。
|
Causes of Carryover |
本年度①自殺遺伝子HSVtkのiPS細胞に対する細胞毒性の原因を検討し、②CRISPR/Cas9ゲノム編集技術を用いて、ハウスキーピング遺伝子領域等に自殺遺伝子を挿入したiPS細胞を樹立するところまでを計画していたが、メタボローム代謝解析に予定よりも時間を要した。その理由として、HSVtkには、Classical HSVtk、N-terminal deletion delta-HSVtk、humanized and CPG free type of HSVtkがあり、それぞれに検討が必要であり、さらにiPS細胞に対する細胞毒性だけでなく、その他の細胞(HeLa細胞等)に対する影響も検討する必要があったためである。しかし、結果として記載の通り細胞毒性の原因を同定することができたため、次年度にウイルスベクターによる位置効果による自殺遺伝子の不活性化の対策として②CRISPR/Cas9ゲノム編集技術を用いて、ハウスキーピング遺伝子領域等に自殺遺伝子を挿入したiPS細胞を樹立する。
|
Research Products
(2 results)
-
-
[Presentation] HSV-TK suicide gene therapy for glioblastoma using neural stem/progenitor cells derived from human induced pluripotent stem cells2019
Author(s)
Hiroyuki Miyoshi, Ryota Tamura, Yukina Morimoto, Oltea Sampetrean, Chizuru Iwasawa, Yutaka Mine, Minoru Narita, Hideyuki Saya, Kazunari Yoshida, Hideyuki Okano, Masahiro Toda
Organizer
Annual Meeting of JSGCT