Development of the specific inhibitor for skeletal musle myosin light chain kinase

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K15366
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 大矢 良平 大阪大学, 医学部附属病院, 医員 (50728053)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: 骨格筋型ミオシン軽鎖キナーゼ / 化合物スクリーニング / 酵素活性測定 / 筋痙縮 / 神経筋疾患

Outline of Annual Research Achievements

脳梗塞や外傷後の筋痙縮には現在有効な薬物治療がない。骨格筋特異的ミオシン軽鎖キナーゼ（skMLCK）によるミオシン制御軽鎖のリン酸化は骨格筋の収縮を調整する重要な分子機構であり、skMLCKの作用を阻害することで筋弛緩を引き起こし筋痙縮に対する症状軽減効果があると思われる。現在、同酵素を標的とする薬剤は開発されておらず、本研究ではskMLCKの更なる生化学的機構、分子機構解析を行うと同時に、skMLCKに作用する低分子化合物を同定し、新規筋弛緩薬開発を行っている。
実際には200,000化合物をscreeningするため、まずは1536 well plateでのHigh throughput系を構築した。2018年には東京大学フルライブラリを用い、High Throughput Screeningを実施し、skMLCKの阻害剤、活性化剤を同定することに成功した。primary hit化合物はconfirmation assayを行い、 さらに、skMLCKと同じMLCKファミリーである平滑筋特異的ミオシン軽鎖キナーゼ（smMLCK）に対するcounter assayを行い、smMLCKに活性を示すものを除外した。最後にtiteration assayにて濃度依存性を示した106個の阻害薬と12個の活性化剤を抽出することに成功した。これら化合物の活性をさらに細かいconfirmation assay, titeration assayを行い活性を確認している。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

当初予定していたskMLCKに対するHigh throughput screeningは成功し最終的に106個の阻害剤と12個の活性化剤を抽出することができた。また、ex-vivoでの筋収縮測定系として、ラットおよびマウスでの摘出筋、またはin situでの筋収縮測定系の構築に成功した。具体的には長肢伸筋を直接電気刺激、もしくは坐骨神経を刺激し長肢伸筋の収縮力を測定する系であり、これらを薬剤投与による筋収縮力評価に用いる。

Strategy for Future Research Activity

筋収縮力が低下する神経筋疾患にも筋痙縮同様に有効な治療法が存在しない。今回見つかったskMLCKの活性化剤は筋萎縮性側索硬化症(ALS)などで起きる筋力低下に効果を示す可能性がある。現在ALSモデルマウスへの化合物投与での筋収縮力増強作用の測定を試みている。またアデノ随伴ウイルスを用い、skMLCKをALSモデルマウスの骨格筋に遺伝子導入し、筋収縮力の変化を測定する予定である。