2019 Fiscal Year Research-status Report
ECEL1/DINE遺伝子変異による先天性関節拘縮症発症メカニズムの解明
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18K15379
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
永田 健一 大阪大学, 医学系研究科, 寄附講座講師 (50587798)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | ECEL1/DINE / 運動神経 / RNA-seq / コンディショナルノックアウトマウス |
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| Outline of Annual Research Achievements |
これまでに申請者は、胎生期の運動ニューロンにおけるECEL1/DINEの機能解析を行ってきた。本年度は、前年に完成したfloxマウスを利用して時期特異的に遺伝子の機能を欠失することにより、当該遺伝子の生後のマウス運動ニューロンでの機能に焦点を当て研究を進めた。機能の探索には舌下神経損傷モデルを採用した。当該遺伝子は、損傷舌下神経核における顕著な発現上昇を指標に同定された経緯があり（Kiryu-Seo et al., PNAS 2000)、損傷後の運動ニューロンにおいて何らかの役割を担っていることが想定された。損傷神経細胞に特異的なCre発現マウス（Kiryu-Seo et al., Sci Rep 2016）と交配させ、神経損傷後3日目、7日目に神経核を回収した。wild-typeおよび損傷特異的コンディショナルノックアウトマウス（cKO）のそれぞれの舌下神経核からRNAを抽出した後、イルミナ社の次世代シークエンサーによりRNA-seqを行った。サンプルあたりのリード数は3000万とした。定法に従って遺伝子発現を解析したところ、ECEL1/DINE遺伝子の発現はwild-typeでは損傷後に著しく上昇していた一方で、cKOサンプルでは非損傷時よりも逆に低下しており、実験系が適切に進んでいると考えた。また、損傷後に発現変動した遺伝子リストを使ってエンリッチメント解析を行ったところ、炎症関連の応答などwild-typeと類似のカテゴリーが多くヒットしていた。さらに、wild-typeマウスとcKOマウス間で比較解析を行ってみると、神経伝達物質関連の一部のカテゴリーに違いが認められた。
なお、cKOマウスからの舌下神経核の単離は名古屋大学の桐生准教授、シークエンス解析は大阪大学の元岡助教の協力を得て行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
初年度に作製したfloxマウスと特異的なCreマウスを組み合わせることで、損傷運動ニューロンにおけるECEL1/DINEの機能を探索することが可能となった。また、RNA-seqの遂行により、関連分子の抽出など、ECEL1/DINEの欠失によって生じる細胞の異常が分子レベルで評価できるようになった。
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| Strategy for Future Research Activity |
まず、RNA-seqの結果の妥当性・再現性を検証する。また、結果を踏まえ、追加で必要なシークエンスを行っていく。さらに、情報解析の専門家の協力を得ることで、取得したシークエンスデータの有用性を高め、ECEL1/DINEの欠失に伴う異常を分子レベルで特定する。
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| Causes of Carryover |
効率的な研究費の使用により生じた。生じた使用額は翌年度分と合わせて、追加のシークエンス解析、シークエンス解析の妥当性検証のための実験試薬および消耗品の購入にあてる。
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