デジタルPCRと生菌のみ検出するPCR法を組み合わせた新たな迅速薬剤感受性検査法

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K15384
• Research Institution: University of Yamanashi
• Principal Investigator: 荻原 真二 山梨大学, 医学部附属病院, 臨床検査技師 (80790005)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: viability PCR

Outline of Annual Research Achievements

本研究の目的は、薬剤感受性が判明するまでの時間が数時間程度へと大幅に短縮できるデジタルPCRを使用した定量的viability PCR法を利用した迅速薬剤感受性検査法の構築である。
平成30年度は以下の検討を行った。
1.血液サンプルから微量な細菌を検出できる半自動核酸抽出法のプロトコルを作製した。血液中の細菌数 5.6 CFU/mLまで安定的に検出できることを確認した。
2.single copy gene (SCG)のユニバーサルプライマー作製の検証を行った。これまでSCGのユニバーサルプライマーの報告がないため、数十のSCGを解析し、ある蛋白のA遺伝子でグラム陽性菌のユニバーサルプライマープライマープローブを作製し、さらに属名の異なる3種のグラム陽性菌のA遺伝子の合成遺伝子も作製した。作製したプライマープローブと各グラム陽性菌の合成遺伝子においてデジタルPCRでの定量核酸増幅が確認でき、希釈直線性も優れていた。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

平成30年度の目的は、プライマー作製と微量な微生物検出とした。本年度はそれら目的を達成することができたため、順調に進展していると評価した。

Strategy for Future Research Activity

グラム陰性菌のユニバーサルプライマープローブを作製中である。実際の菌株から抽出したゲノムを用いてデジタルPCRでの定量性を確認する予定である。さらに、抗菌薬処理をした菌株を用いて定量的viability PCR法の評価を行う。