2018 Fiscal Year Research-status Report
ミトコンドリアがオートファジーを制御する新機構と老化随伴疾患代謝物の探索
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18K15421
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| Research Institution | Kyushu University |
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Principal Investigator |
八木 美佳子 九州大学, 大学病院, 学術研究員 (70536135)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | ミトコンドリア / NAD / オートファジー / ノックアウトマウス / 老化 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
老化に伴う多くの疾患はミトコンドリア機能、オートファジー機能, 血中NAD量低下が関与すると考えられているがその詳細な分子機構は明らかでない。我々が作成した、ミトコンドリア機能不全マウスの解析から心筋特異的ノックアウトマウスでは拡張型心筋症を早期に呈することを見出し、寿命は約500日に減少することを突き止めた。このマウスの心臓を用いて様々な解析を行った。
メタボローム解析を行い、ミトコンドリア機能不全マウスではNAD量が減少していることがわかった。さらにNAD合成酵素の発現を確認すると軒並み減少していた。特にsalvage経路の発現に大きな変化が確認できたので、NAD合成酵素のうちNmnatに着目してその活性を測定するとやはり減少していた。オートファジー関連因子についても発現を調べるとp62、p62リン酸化とLC3のタンパク質レベルでの発現は増加していた。心臓組織の免疫染色でもこれらのオートファジーマーカータンパク質の局在に変化が確認できた。したがってこのミトコンドリア機能不全マウスではオートファジーを抑制してると考えられる。ではオートファジーのどの経路に影響を及ぼしているのか。心臓組織の電子顕微鏡解析で確認するとオートファジーの特にリソソーム形態に異常がみられた。以上の結果よりミトコンドリア機能不全が引き金となり、NAD合成量とそのNAD合成酵素発現量の低下、オートファジーの特にリソソーム形態異常、が確認できた。心臓組織での解析はおおむね終了したため、培養細胞において詳細なメカニズムの解析を行う。そのための様々な条件検討もおおむね終了した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ノックアウト心筋組織、及び樹立MEF細胞内NAD+、NADH、 NADP、 NADPHの量を研究室内の質量分析器LC/MS/MS、GC/MS/MSにおいて定量した。NAD合成系（de novo合成系、サルベージ系）に関与する酵素 (Nampt、Nmnat-1、-2、-3、 Qaprt、Naprt、NADsyn1) 8種類の遺伝子発現プロファイル、Nmnat活性測定など、NAD合成に関して心臓組織でできる機能解析は全て終了した。またオートファジーに関するRNA、タンパク質、の発現確認、組織染色や電子顕微鏡解析により形態異常も確認できた。組織で行う予定であった実験はほぼ終了した。今後はさらなるメカニズム解明に向けて培養細胞での解析を行う予定である。そのために必要な細胞も作製した。さらにNAD合成阻害剤を用いた実験を行うための条件検討も行っている。阻害剤の濃度、添加時間は決定している。細胞を用いてリソソームの機能解析を主に行う予定なので、LysotrackerRed、pHセンサー、などの試薬の検討やリソソームの精製方法の確立、その活性測定の方法、などの検討も行った。これらの検討を基に実際にデータをとっていく予定である。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後はさらなるメカニズム解明に向けて培養細胞での解析を行う予定である。すでに条件検討はできているので、培養細胞を用いてリソソーム機能解析を行う。ミトコンコリア機能低下によって引き起こされるNAD合成量低下が原因となりリソソーム機能が低下することを証明する。阻害剤を用いてNAD合成を止めるとリソソーム機能低下を引き起こすことをLysotrackerRed、pHセンサーをもちいて検証する。また阻害剤を添加した時のRNAやタンパク質発現を確認、免疫染色によって形態変化があるのか、そのことがオートファジー機能低下につながるのか、検証する。さらにリソソームを精製して実際に活性を測定する。
メタボローム解析によりp32cKO及びp32 / ATG5ダブルノックアウトマウスの代謝産物を測定する。当教室にはすでに質量分析器が稼働しており、中央代謝系、脂質を中心に約300種類の代謝物の解析が可能である。20週齢のマウスの心臓組織を単離しエタノール抽出後LC/MS/MS、 GC/MS/MSを用いて代謝物を測定する。解析結果から、オートファジー不全、リソソーム不全の予測マーカーの探索を試みて、実際に老化に伴うオートファジー疾患のマーカーになりうるのか、その意義、妥当性を検証し病態検査、治療効果判定など実臨床に応用する。
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| Causes of Carryover |
今年度は既に研究室にある物品、試薬、機械、を用いることができたため予算使用額が予定より少なかった。今年度は新たな系を立ち上げるため、試薬と物品が多く必要になる。また学会発表や論文作成などを行う予定であるため、今年度の方が多く予算が必要となる。
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Research Products
(3 results)
