2018 Fiscal Year Research-status Report
Research for the pathogenesis and therapy of dysferlinopathy: Focusing on mechanisms of plasma membrane repair
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18K15437
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| Research Institution | Tohoku University |
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Principal Investigator |
小野 洋也 東北大学, 医学系研究科, 大学院非常勤講師 (90803578)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | dysferlin / 筋ジストロフィー / 細胞膜修復 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
dysferlinopathyでは、たとえ同じ遺伝子変異を有する同胞間であっても、臨床的に近位筋優位の筋萎縮・筋力低下を示す肢帯型筋ジストロフィー2B型を呈する場合と、下腿後面の筋群が強く障害される三好型遠位型筋ジストロフィーを呈する場合があることから、修飾遺伝子の存在が示唆された。また、dysferlinは約230 kDaの大きな膜タンパク質であることから、結合タンパク質を介して細胞膜修復の機能を発揮すると考えられた。従って、新規結合タンパク質を同定することが、まだ全容が明らかでない筋細胞膜修復機構の解明、さらにはdysferlinopathyの治療法開発につながると考えられた。
本研究では、dysferlinのドメイン構造に着目し、特定領域のアフィニティカラムを作成した。このカラムに細胞抽出物を反応させて相互作用するタンパク質を抽出し、SDS-PAGEにより分離して、質量分析にかけることで、複数の結合タンパク質を同定した。同定した結合タンパク質の一つであるProtein X（論文投稿中）に注目し、レーザー膜損傷の実験系を用いて解析を行った。マウス骨格筋においてProtein Xがレーザーによる膜損傷部位に集積し、また培養細胞においてX遺伝子発現抑制が筋細胞膜修復機能の低下に繋がることを発見した。さらにdysferlin欠損マウス骨格筋のレーザー膜損傷で、ProteinXの損傷部位への集積が遅延することから、膜修復機構において、dysferlinがXの局在を規定していると考えられた。さらにdysferlin変異をもつ患者初代培養細胞とdysferlin欠損マウス骨格筋において、X活性化剤の投与により膜修復機能が改善することを見出した。X活性化剤は他疾患の臨床で既に用いられている薬剤であり、ドラッグ・リポジショニングとしての臨床応用が期待できる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
Protein Xが、dysferlinとともに骨格筋の膜修復機構において重要な働きを担っているという新たな知見は、根治療法がいまだないdysferlinopathyの治療法開発に結びつく可能性がある。X活性化剤の臨床応用を目指し、動物モデルを用いて、薬剤投与による運動機能や骨格筋構造の異常回復効果について検証を行っている。
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| Strategy for Future Research Activity |
臨床応用のためにはモデル動物での検証実験が重要である。2種類の動物を用いる。
1.ゼブラフィッシュモデル：申請者らは、ゼブラフィッシュに対するmorpholino分子を用いたdysferlinopathyモデルを確立している。初期胚にmorpholinoを用いたdysferlinopathyモデルでは生後3～4日に約35%の割合で、骨格筋の構造異常が観察される。ゼブラフィッシュの骨格筋の状態は、偏光フィルターを用いた複屈折解析（Birefringence assay）により簡便に検出することができる。このモデルに対して、生後4日間薬剤処理を行い、筋構造異常に対する回復効果を検討する。
2.マウスモデル：不完全ながらdysferlinの発現がみられるSJL/Jマウスとdysferlin完全欠損のBLA/Jマウスを用いてX活性化剤の投与実験を行う。本薬剤は他疾患で臨床応用されており、マウス/ヒトにおける年単位での長期投与の安全性も確立されている。dysferlin変異マウスは、筋ジストロフィーを発症するまで7～8ヶ月を要する。離乳直後より薬剤投与を開始し、骨格筋変性発症後に組織学的な評価を行って、治療効果について判定する。また、握力などの運動機能と体重についても評価を行う。
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| Causes of Carryover |
次年度使用額が生じた理由：当初購入を予定していた、抗体の購入費が少なく済んだため。
次年度の使用計画：助成金は主に本研究を遂行するための物品費（細胞生物学的解析に必須の試薬：細胞培養試薬、遺伝子抽出試薬、抗体などの消耗品）、in vivo での検証のためのマウス繁殖・系統維持費として使用する予定である。また、積極的な研究成果の発表のために必要な最低限の旅費、論文投稿費・ポスター作成等の印刷費などに使用する予定である。
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Research Products
(3 results)
