パーキンソン病におけるドーパミン神経細胞特異的な新たな病態発症機構の解明

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K15466
• Research Institution: Juntendo University
• Principal Investigator: 横田 睦美 順天堂大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (10647415)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: iPS細胞 / ドーパミン神経細胞 / CRISPR/Cas9 / GFP標識

Outline of Annual Research Achievements

本研究ではiPS細胞由来ドーパミン神経細胞をGFP標識することによりドーパミン神経特異的なミトコンドリア機能・形態解析を可能にし、パーキンソン病におけるドーパミン神経特異的な変性機序を見出すことを主目的としている。
今年度はドーパミン神経細胞特異的にGFPを発現するiPS細胞の樹立を目指した。ドーパミン神経に特徴的なマーカーTyrosine Hydroxylase（TH）遺伝子へGFP遺伝子をCRISPR/Cas9システムによりノックインするため、まずヒトTH遺伝子エクソン12内ターゲット配列を含むsgRNA発現ベクターを作製した。また、切断部位に隣接した相同配列を含むドナーベクターを作製した。作製したこれらのベクターとCas9ベクターを健常者及びPARK2患者iPS細胞へ導入し、薬剤セレクションとPCRを行った結果、標的部位にGFP遺伝子が挿入されたTH-GFP iPS細胞が健常者、患者共に複数クローン得られたことが明らかになった。これらのTH-GFP iPS細胞から分化誘導させたドーパミン神経細胞においてGFPの発現を確認した。さらに、TH-GFP iPS細胞由来ドーパミン神経細胞のTH抗体とGFP抗体による免疫染色の結果、同じパターンの染色像が得られた。これらの結果から、ドーパミン神経細胞特異的にGFPを発現する健常者及びPARK2患者iPS細胞株の獲得に成功したことが確かめられた。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

今年度の研究により、ドーパミン神経細胞においてGFPを発現するパーキンソン病患者iPS細胞株が得られた。これまでTH遺伝子にレポーターをノックインしたiPS細胞は健常者についてのみ報告されており、患者TH-GFP iPS細胞の樹立については未だ報告がなかった。今後、作製したTH-GFP 患者iPS細胞由来ドーパミン神経細胞の光顕電顕相関観察法（CLEM）を用いたミトコンドリア超微形態学的解析を行うことによりパーキンソン病に至る形態的特徴を見出す可能性があり、患者TH-GFP iPS細胞株の獲得は重要な進展であったといえる。
また、今回作製したTH-GFP iPS細胞株はドーパミン神経細胞への分化に伴い持続的にGFPを発現するため、iPS細胞からドーパミン神経細胞への分化誘導法の改良等にも有用である。さらに、今回作製したsgRNA発現ベクターやドナーベクターは、他の疾患特異的iPS細胞を用いたTH-GFP iPS細胞株の作製にも応用可能であるため、本研究結果は重要な成果である。

Strategy for Future Research Activity

今後は、光顕電顕相関観察法（CELM）を用いてTH-GFP iPS細胞由来ドーパミン神経細胞とその他サブタイプの神経細胞との比較解析や健常者と患者間の比較解析を行い、パーキンソン病ドーパミン神経に特徴的なミトコンドリアの超微形態学的変化を明らかにする。

Causes of Carryover

今年度は子の出産による産前産後・育児休暇の取得により実験を約11ヶ月間停止した。従って、予定していた新たに購入する消耗品費や学会経費等は未使用となった。
次年度は作製したTH-GFP iPS細胞の評価及びTH-GFP iPS細胞由来ドーパミン神経細胞の形態解析を主に行うため、培養関連試薬や形態解析用試薬のために研究費の大部分を使用する。また、電顕解析用標本作製依頼のための人件費、研究成果を発表するための学会経費や論文投稿費にも使用する。