Analysis of TBCD gene mutation and deletion in novel neurodegenerative diseases

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K15678
• Research Institution: University of Miyazaki
• Principal Investigator: 池田 俊郎 宮崎大学, 医学部, 准教授 (20423717)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: 遺伝子改編マウス / 疾患モデル / 胎児致死 / 早発性脳症 / チューブリン

Outline of Annual Research Achievements

Tbcd遺伝子exon31を改編したマウス(点突然変異:KI、13塩基欠失:KO)を飼育して、臨床型を評価した。KIのホモマウス・ヘテロマウス、KOのヘテロマウスは健常と変わらない運動機能をもち、KOのホモマウス(KO-/-)は生存した出生仔を得られなかった。表現型とホモマウスの出生状況から、Tbcd遺伝子異常のマウス疾病モデルには、KO-/-の胎児評価が適切であると考えられた。
E12.5でKO-/-が確認されたのは2例で、うちHE染色による組織を得られた検体は1例、まだトロポブラストのような幼若な形態であった。KO-/-の胎児致死の時期や機序を今後明らかにすることで疾病の病態生理や機序の解明にアプローチしたい。。
当初はより早い時期に帝王切開し、胎仔が死滅する時期およびKO-/-が確認できる時期を明らかにする方策としたが、母体DNAの混入のためか胎仔Genotypingに難渋している。
いくつか改善の方策を試みているが、2019.5月の時点ではまだ改善策を模索中である。
現在、母体からのDNA混入がジェノタイピングを困難にしている可能性が最も考えられている。母体血の灌流などはひきつづき試みていく。ほかの方策として、（E12.5での評価の難渋が胎仔形成そのものでなくGenotypingの困難により評価できないのであれば）胎仔が大きい方が胎児のみのDNAを評価できるため、今後は再度のE12.5やE14.5で評価を検討していく。
より簡便、迅速にKO胎仔マウスを評価すべく、Steponeシステムを用いたqPCRによる評価系をサーモフィッシャーサイエンティフィックの協力を得て作製した。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

Tbcd遺伝子exon31を改編したマウス(点突然変異:KI、13塩基欠失:KO)を飼育して、臨床型を評価した。KIのホモマウス・ヘテロマウス、KOのヘテロマウスは健常と変わらない運動機能をもち、KOのホモマウスは生仔を得られなかった。TBCD遺伝子異常の疾病モデルには、KOホモマウスの胎児評価が適切であると考えた。
生まれてきたKO胎仔マウスの遺伝子変異の評価は、当方でプライマーを作製したサンガーシークエンスを用いた。より簡便、迅速にKO胎仔マウスを評価すべく、Steponeシステムを用いたqPCRによる評価系をサーモフィッシャーサイエンティフィックの協力を得て作製した。これにょり、ごく微量のDNAから迅速に胎仔のKOホモ、KOヘテロ、Wtを評価できるようになった。日齢12.5日前後(E12.5)で、2018/5月.10月にKOヘテロマウス同士を交配し、帝王切開を行った。それ以前の事例も踏まえるとE12.5 でのべ70-80体前後の胎児を得たが、KO-/-が確認できたのが2例である。このうち1例はごく小さく萎縮していたのでGenotypingのみ試行、もう1例、唯一HE染色による組織を得られた検体は、まだトロポブラストのような幼若な形態であった。
当初はKO-/-は、E12.5 では多くの場合死滅してしまっていると考えた。より早い時期に帝王切開し、死滅する時期・KO-/-が確認できる時期を明らかにする方策とした。が、E8.5から9.5で全例ヘテロKOであった。母体DNAの混入を否定できず、母体かん流、胎仔からのDNA採取を増やす、Steponeとサンガーシーケンスの併用を行ったが帝王切開でも結果は変わらない。

Strategy for Future Research Activity

母体からのDNA混入がジェノタイピングを困難にしているのであれば、胎仔が大きい方が胎児のみのDNAを評価できるため、今後は再度のE12.5やE18.5などで評価を検討する。

Causes of Carryover

実験の進捗から、支給額の20%弱の次年度使用額が発生した。この額は次年度のマウス帝王切開や染色に使用する。E12.5でのKO-/-マウスの再現性がなかなか得られない問題を解決するため、E18.5などに実験の幅を拡げて施行する予定である。実験の幅を拡げるに当たり、この次年度使用額を有効活用する。