遺伝性小頭症責任遺伝子ASPMは神経発生過程において細胞周期と細胞死を制御するか

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K15683
• Research Institution: Kyoto Prefectural University of Medicine
• Principal Investigator: 外崎 円 京都府立医科大学, 医学部, 研究員 (70745637)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: 先天異常学 / 細胞周期 / ASPM

Outline of Annual Research Achievements

(1)Fucci発現脳特異的Aspm欠損マウス（Fucci-NesCre;Aspmflox/flox）の作製：当該マウスを作製するにあたり交配の組み合わせを検討し、Fucci-Aspmflox/floxホモ親とNesCre;Aspmflox/+ヘテロ親の組み合わせが、効率的にFucci-NesCre;Aspmflox/flox (Aspm cKO)を作製できることが分かった。
(2)脳スライスの作製方法の検討：まず、Aspm cKOでアポトーシスが多く発生したE12.5, E14.5における冠状断スライスの効率的な作成方法を検討した。E12.5は大脳壁構造が未発達であり、正確に観察面をとらえることが困難であったが、E14.5は大脳壁が発達しており実体顕微鏡下で取り扱いが可能であった。さらに、ビブラトームと比べ、顕微鏡下で自作の極小メスにより短冊状にスライスすることで、操作工程の簡略化できダメージも少なくFucciの発現が明瞭に確認できた。このことから、E14.5を対象とすることが妥当であると考えた。
(3)Fucci発現細胞のタイムラプス観察：つぎに、脳スライスをコラーゲンで包埋し、顕微鏡に設置したインキュベータ内で培養しながら、5分間隔で16時間連続観察した。既報どおり、Fucciが細胞周期のS/G2/Mを緑色、G1/G0期を赤色の蛍光タンパク質で細胞核を可視化するように、当該マウスにおいても、脳室帯に緑色、中間帯および皮質板に赤色の核を有する細胞を明瞭に認めた。しかし、Fucci蛍光は経時的な変化をするものの、細胞周期に連動するエレベータ運動については下降する緑色の細胞のみ観察され、G1期の上昇する赤色の細胞の挙動をとらえることができなかった。脳スライスでの検証が困難であると考え、現在分散培養系によるタイムラプス観察条件を検討している。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

Fucci-NesCre;Aspmfloxマウスを用いた脳スライスによるタイムラプス観察において、当初計画していた動態観察が困難であることが分かった。現在、当該マウス由来の神経幹細胞を用いた方法に変更し、解析を進める予定である。

Strategy for Future Research Activity

(1)タイムラプスによる細胞周期解析：まず、G1期の核が赤色の蛍光、S/G2/M期の核が緑色の蛍光を発するFucciを発現する遺伝子改変マウス由来の野生型神経幹細胞（NSC）を用いて、観察条件を確立する。この方法を用いて、Fucci-NesCre;Aspmflox/flox(Aspm KO)胎仔由来のNSCの挙動と比較する。さらに、観察終了時点でのNSCサブタイプを蛍光細胞染色などで解析し、増殖・分化および、対称・非対称分裂情報を取得し、単一細胞レベルでのWTとAspm KOの違いを調べる。
(2)遺伝子発現解析：胎齢14.5日目のAspm KOおよび野生型の胎仔脳の側脳室周囲増殖細胞層を回収し、Aspm依存的に変動するDNA損傷修復関連分子、アポトーシスに関連する遺伝子群を判別する。

Causes of Carryover

初年度の計画に変更が生じ、解析方法の追加に伴い前倒し請求を実施した。これは、解析用の当該マウスの作製、輸送費および細胞培養関連費への充当を予定していた。しかし、想定よりもマウス作製の効率が高くなり、作製回数が抑えられ輸送費に余剰が出た。次年度は、野生型と変異型間の遺伝子発現解析を行う。さらに培養細胞を用いたタイムラプス解析により、蛍光色および細胞形態から増殖・分化、対称・非対称分裂情報の取得および細胞死の有無を検証する。これらにより、神経幹細胞の細胞周期制御とアポトーシス発生におけるAspmの役割を推察する。