遺伝性小頭症責任遺伝子ASPMは神経発生過程において細胞周期と細胞死を制御するか

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K15683
• Research Institution: Kyoto Prefectural University of Medicine
• Principal Investigator: 外崎 円 京都府立医科大学, 医学部, 研究員 (70745637)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: 先天異常学 / 細胞周期 / ASPM

Outline of Annual Research Achievements

【平成30年度】
(1)Fucci発現脳特異的Aspm欠損マウス（Fucci-NesCre;Aspmflox/flox）の作製：当該マウスを作製するにあたり交配の組み合わせを検討し、Fucci-NesCre;Aspmflox/floxホモ親とNesCre;Aspmflox/+ヘテロ親の組み合わせが、効率的にFucci-NesCre;Aspmflox/flox (Aspm cKO)を作製できることが分かった。
(2)脳スライスの作製方法の検討：まず、Aspm cKOでアポトーシスが多く発生したE12.5, E14.5における冠状断スライスの効率的な作成方法を検討した。脳スライスの作製の操作性などを考慮したところ、操作工程の簡略化できダメージも少なくFucciの発現が明瞭に確認できたE14.５を対象とすることが妥当であると考えた。
(3)Fucci発現細胞のタイムラプス観察：つぎに、脳スライスをコラーゲンで包埋し、顕微鏡に設置したインキュベータ内で培養しながら、5分間隔で16時間連続観察した。既報どおり、Fucciが細胞周期のS/G2/Mを緑色、G1/G0期を赤色の蛍光タンパク質で細胞核を可視化するように、当該マウスにおいても、脳室帯に緑色、中間帯および皮質板に赤色の核を有する細胞を明瞭に認めた。しかし、Fucci蛍光は経時的な変化をするものの、細胞周期に連動するエレベータ運動については下降する緑色の細胞のみ観察され、G1期の上昇する赤色の細胞の挙動をとらえることができなかった。
【平成31年度/令和元年度】
脳スライスから分散培養系への変更：新たにタイムラプス観察条件を検討した。培養密度、ガラスコーティング条件などを考慮し最大で培養後7日目までの観察が可能とした。その結果、形態的差異が見いだされ、現在分子レベルでの検証を進めている。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

手法変更に伴う条件検討は、おおむね完了したが、評価数の確保のためのサンプル作製が遅れている。

Strategy for Future Research Activity

（１）タイムラプスによる細胞周期解析：G1期の核が赤色の蛍光、S/G2/M期の核が緑色の蛍光を発するFucciを発現する遺伝子改変マウス由来の神経幹細胞（NSC）を用いて、観察条件を確立した方法を用いて、Fucci-NesCre;Aspmflox/flox(Aspm KO)胎仔由来のNSCの挙動と比較する。さらに、観察終了時点でのNSCのサブタイプを調べ、増殖・分化および、対称・非対称分裂情報を取得し、単一細胞レベルでのWTとAspm KOの差を調べる。
（２）遺伝子発現解析：胎齢14.5日目のAspm KOおよび野生型の胎仔脳の側脳室周囲細胞増殖細胞層を回収し、Aspm依存的に変動するDNA損傷修復関連分子、アポトーシスに関連する遺伝子群を判別する。

Causes of Carryover

本研究の中核をなすトランスジェニックマウスの作製において、目的とする遺伝子型を有する胎仔の獲得率が想定よりも低く検証回数が十分確保できず、大幅に予定が遅れた。さらに、当初計画した解析系に変更が必要となり、新たな手法での方法論の検証のための消耗品の購入および、トランスジェニックマウスの作製が必要となった。