遺伝性小頭症責任遺伝子ASPMは神経発生過程において細胞周期と細胞死を制御するか

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K15683
• Research Institution: Kyoto Prefectural University of Medicine
• Principal Investigator: 外崎 円 京都府立医科大学, 医学部, 研究員 (70745637)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: 先天異常学 / 細胞周期 / ASPM

Outline of Annual Research Achievements

【平成30年度】
（１）Fucci発現脳特異的Aspm欠損マウス（Fucci-NesCre;Aspmflox/flox）の作製：当該マウスの作製条件を検討し、Fucci-NesCre;Aspmflox/floxホモ親とNesCre;Aspmflox/+ヘテロ親の組み合わせで、効率的にFucci-NesCre;Aspmflox/flox (Aspm cKO)を作製できた。（２）脳スライス法による動態解析：E14.5由来の脳スライスを使用し、Fucci発現細胞のタイムラプス観察条件を検討した結果、コラーゲン包埋した脳スライスを16時間連続観察ができた。Fucciが細胞周期に連動して脳室帯で緑色、中間帯および皮質板で赤色の核を有する細胞を明瞭に認めたが、Fucci蛍光は経時的な変化をするものの、細胞周期に連動するエレベータ運動については下降する緑色の細胞のみ観察され、細胞分裂やG1期の上昇する赤色の細胞の挙動をとらえることができなかった。
【平成31年度/令和元年度】
判明した問題を解決するために、脳スライスから分散培養系による動態解析への変更を行った。初めに、神経幹細胞(NSC)の培養・観察条件を検討し、胎仔脳より分離した細胞から形成させたニューロスフェアを介する方法が効果的であることが分かった。この方法により、野生型・Aspm cKOのNSCを同一環境下で観察するための細胞調整条件を整えた。そのうえ、観察条件を検討し、最大で培養後7日目までの観察を可能とした結果、野生型とcKO間の形態的差異を見出した。
【令和２年度】
さらに、アポトーシスの発生と細胞周期の関連を検証するために、Fucci蛍光の解析を試みたが、顕著な差異は確認されなかった。その結果、当初予想していたアポトーシスへの細胞周期の関係は乏しい可能性が示唆された。引き続き、分子レベルでの変化について検討している。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

解析系の改善に向けたサンプル数の確保が遅れたことにより、動態解析および分子レベルの検証への遅れも生じたため。

Strategy for Future Research Activity

遺伝子発現解析：胎齢12.5日目の胎仔由来の神経幹細胞または、胎齢14.5日目のAspm KOおよび野生型の胎仔脳の側脳室周囲細胞増殖細胞層を回収し、Aspm依存的に変動するDNA損傷修復関連分子、アポトーシスに関連する遺伝子群を判別する。

Causes of Carryover

本研究の中核をなすトランスジェニックマウスの作製において、目的とする遺伝子型を有する胎仔の獲得率が低い傾向が続き検証回数が十分確保できず、大幅に予定が遅れた。この結果、実施困難であった遺伝子発現解析を遂行するため消耗品の購入が必要となった。