2019 Fiscal Year Research-status Report
メンデル遺伝病に対する無侵襲出生前遺伝学的検査の臨床応用
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18K15690
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| Research Institution | Fujita Health University |
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Principal Investigator |
野田 佳照 藤田医科大学, 医学部, 助教 (10767338)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 無侵襲的出生前遺伝学的検査 / cell-free DNA |
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| Outline of Annual Research Achievements |
出生前診断において、妊婦の採血による無侵襲的出生前遺伝学的検査(NIPT)が注目されているが、現時点で、メンデル遺伝性疾患への応用はほとんど進んでいない。その主な原因として、母親と胎児由来ゲノムDNAを高精度に区別することができないためと考えられる。そこで本研究では、母親と胎児由来ゲノムDNAを高精度に区別する手法を開発するとともに、重篤なメンデル遺伝性疾患保因者夫婦に対し臨床応用が可能な非侵襲性出生前診断法の確立を目的とした。
当該年度に実施した研究成果は以下の通りである。X連鎖性疾患など母親が同じ原因遺伝子変異を有している場合は、胎児における変異の同定は非常に困難である。これまでの報告で母体血漿中に含まれるcfDNAのサイズ分布を調べると、胎児由来cfDNAでは母親由来cfDNAよりもサイズが小さいことが示されておりこの特徴を利用し、母体血漿から抽出したcfDNAから、胎児由来cfDNAを濃縮し、モザイク率を高めてからdeep sequenceすることにより、胎児の遺伝子変異の有無を明らかにする。一方、cfDNAは断片化が進んでおり、cfDNAやcfDNA由来のPCR産物を断片化し、アダプター配列のライゲーションを行うのは難しい。そのためPCRプライマーの5’末端にシーケンス用のアダプターを付加したtailed PCRを用いて、目的遺伝子領域の増幅を行う。アダプター配列が付加されたPCR産物をNGSでdeep sequenceし、変異箇所を数万回繰り返し読むことで低頻度モザイクの検出を試みる。これまでの報告では、この方法で0.03%程の低頻度モザイク変異の検出に成功しており (Narumi S et al. PLoS One 2013)、本研究も同様の方法で、胎児由来De novo変異の検出に成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
初期に設定した研究実施計画通りに研究が進んでいるため。
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| Strategy for Future Research Activity |
検査精度の向上のために、疾患の遺伝子変異のPCRと同時に、複数のcommon SNPを含む領域をmultiplex PCRで増幅後にシークエンスし、全リード数から各SNP のマイナーアリル頻度 (minor allele frequency = MAF)の割合を算出するとともに、各SNP の遺伝子型が母親:胎児=AB:ABと母親:胎児=AB:AAとなるMAFの閾値を 決定する。その後、原因遺伝子変異のMAFの割合が、母親: 胎児=AB:ABと母親:胎児=AB:AAのどちらのグループに属するか決定し、母親の遺伝子変異が胎児に遺伝 しているかを決定する。 本研究では常染色体劣性遺伝、もしくはX連鎖性疾患の保因者妊婦の血漿を同時に収集し、cfDNAを抽出後に、tailed PCRにより common SNP領域と原因遺伝子変異の領域を増幅し、NGSで解析する。また、出産に至った児の表現型、もしくは遺伝子型からNIPTの結果について判定する。
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| Causes of Carryover |
検査精度の向上のために、疾患の遺伝子変異のPCRと同時に、複数のcommon SNPを含む領域をmultiplex PCRで増幅後にシークエンスし、全リード数から各SNPのマイナーアリル頻度 (minor allele frequency = MAF)の割合を算出するとともに、各SNPの遺伝子型が母親:胎児=AB:ABと母親:胎児=AB:AAとなるMAFの閾値を決定する。その後、原因遺伝子変異のMAFの割合が、母親:胎児=AB:ABと母親:胎児=AB:AAのどちらのグループに属するか決定し、母親の遺伝子変異が胎児に遺伝しているかを決定する。そのために、日本人でMAF=50%のSNPを含む領域をPCRで増幅するプライマーを複数デザインするとともに、胎児由来cfDNAの割合が多くなるようPCR産物のサイズを工夫する。そして、常染色体劣性遺伝、もしくはX連鎖性疾患の保因者妊婦の血漿を同時に収集し、cfDNAを抽出後に、tailed PCRによりcommon SNP領域と原因遺伝子変異の領域を増幅し、NGSで解析する。得られたデータをこれまでの実験データと合わせることにより胎児遺伝子型を決定する。さらに、出産に至った児の表現型、もしくは遺伝子型からNIPTの結果について判定する。
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