骨形成不全症に対する骨カップリングを標的とした新規治療薬の開発

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K15708
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 大幡 泰久 大阪大学, 医学系研究科, 助教 (20805460)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: 骨形成不全症

Outline of Annual Research Achievements

骨形成不全症(OI)は主にⅠ型コラーゲンの異常により骨脆弱性を呈する先天性骨系統疾患である。本疾患に対してビスホスホネート製剤による姑息的治療が行われているが重症例においては治療効果が乏しい。通常骨は破骨細胞による骨吸収と骨芽細胞による骨形成からなる骨カップリングが正常に起こることで骨強度が維持されている。また破骨細胞と骨芽細胞の間には双方向性の骨カップリング機構があり、これにより骨リモデリングが調整されている。本研究では骨カップリング異常を標的としたOIに対する新規治療の開発を目的とする。
OIにおける骨カップリング異常を明らかにするため、OIモデルマウス由来破骨細胞と、骨芽細胞の初代培養を行う。次に骨リモデリング異常を規定するカップリング因子を確認し、その機序に作用する薬剤を探求する。そのため本研究ではOIモデルマウスを使用する必要がある。昨年度導入したCol1a2oimマウスの飼育繁殖に成功した。本マウスのhomozygousマウス、heterozygousマウス、野生型マウスを評価し遺伝子変異により骨脆弱性が来されていることの確認に成功した。各genotypeマウス長管骨より骨髄を採取し破骨細胞初代培養に成功した。また骨髄採取後の長管骨組織より播種される骨芽細胞初代培養にも成功した。これら破骨細胞、骨芽細胞における各細胞マーカー(破骨細胞:cathepsin K, NFATc1, 骨芽細胞:ALP, COL1A1, OB-Cadherin, RUNX2, SP7)やカップリングに関わるRANKL,EphBs,Ephrin B2などのタンパク発現をWestern Blottingで検出することにも成功した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本研究を遂行するためにはOIモデルマウスが必要である。これまでの研究により順調に飼育、繁殖に成功し、安定して病態モデルマウスの使用とそのgenotypingが正確に行えるようになった。そして本モデルマウスでその遺伝子変異に応じて骨脆弱性を示すことも明らかとなった。また本研究の主題である骨カップリングを検討するための破骨細胞初代培養と骨芽細胞初代培養にも成功しており、その分化段階を検討するためのマーカーの検出にも成功している。これらの方法を用いて今後本疾患における骨カップリングの異常を見出し、その原因を治療する新規治療法の開発に進めていくことが可能となる。実験の進展は順調であると判断し、上記区分を(2)おおむね順調に進展しているとした。

Strategy for Future Research Activity

Col1a2oimマウスの各遺伝子変異を有するマウス由来初代培養破骨細胞と初代培養骨芽細胞におけるカップリング因子の発現を検討する。次にこれら破骨細胞と骨芽細胞の共培養を行う。この時Col1a2oimマウスと野生型マウスの破骨細胞と骨芽細胞を組み合わせることで4種類の共培養を行う。そして骨芽細胞マーカー(RUNX2, SP7, ALP, COL1A1)、破骨細胞マーカー(NFATc1、Cathepsin K、)の発現を確認するとともに破骨細胞形成能もTRAP染色を行い確認する。これらの実験でOIの病因と考えられるカップリング機構異常を同定したら次にその機構に特異的に作用する薬剤を用いて同様に共培養の実験で治療効果を評価する。最終的にはこれらの実験で同定された薬剤をCol1a2oimマウスに投与し、骨の脆弱性や骨代謝マーカーに対する治療効果を判定する。この時骨病変に及ぼす効果のみならず、歯牙形成不全に対する治療効果も判定する。

Causes of Carryover

当該年度に開始したOIモデルマウスの飼育、繁殖は次年度以降も継続して行う必要があるため次年度使用分を合わせ使用してく。また次年度は分子生物学的実験を拡大していくとともに細胞生物学的実験も拡大していくためそちらに対しても使用していく予定である。

Research Products

• [Journal Article] Comprehensive genetic analyses using targeted next-generation sequencing and genotype-phenotype correlations in 53 Japanese patients with osteogenesis imperfecta (2019)
  • Author(s): Ohata Y., Takeyari S., Nakano Y., Kitaoka T., Nakayama H., Bizaoui V., Yamamoto K., Miyata K., Yamamoto K., Fujiwara M., Kubota T., Michigami T., Yamamoto K., Yamamoto T., Namba N., Ebina K., Yoshikawa H., Ozono K.
  • Journal Title: Osteoporosis International Volume: 30 Pages: 2333, 2342
  • DOI: 10.1007/s00198-019-05076-6
  • Peer Reviewed
• [Presentation] Mutational analysis of the PHEX gene and genotype-phenotype correlation in 37 Japanese patients with X-linked hypophosphatemic rickets (2019)
  • Author(s): Yasuhisa Ohata, Takuo Kubota, Shinji Takeyari, Taichi Kitaoka, Yasuki Ishihara, Hirofumi Nakayama, Yukako Nakano, Kenichi Yamamoto, Kei Miyata, Chieko Yamada, Makoto Fujiwara, Katsusuke Yamamoto, Toshimi Michigami, Hiroyo Mabe, Takeshi Yamaguchi, Katsuyuki Matsui, Izumi Tamada, Noriyuki Namba,Keiichi Ozono et al.
  • Organizer: American society for bone mineral research annual meeting
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] 日本人XLH患者37名のPHEX遺伝子解析結果と表現型相関の検討 Mutational analysis of the PHEX gene and genotype-phenotype correlation in 37 Japanese patients with X-linked hypophosphatemic rickets (2019)
  • Author(s): 大幡泰久, 石原康貴, 窪田拓生, 武鑓真司, 北岡太一, 中山尋文, 中野由佳子, 山本賢一, 藤原誠, 道上敏美, 難波範行, 大薗恵一
  • Organizer: 日本骨代謝学会
• [Presentation] 日本人XLH患者38名のPHEX遺伝子解析結果と表現型相関の検討 Mutational analysis of the PHEX gene and genotype-phenotype correlation in 38 Japanese patients with X-linked hypophosphatemic rickets (2019)
  • Author(s): 大幡泰久, 石原康貴, 窪田拓生, 武鑓真司, 北岡太一, 中山尋文, 中野由佳子, 山本賢一, 宮田京, 山田知絵子, 藤原誠, 山本勝輔, 道上敏美, 難波範行, 間部裕代, 山口健史, 松井克之, 玉田泉, 山本晶子, 江藤潤也, 河口亜津彩, 大薗恵一
  • Organizer: 日本小児内分泌学会