イントロン内配列制御による筋ジストロフィーエクソンスキッピング治療効率化の検証

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K15734
• Research Institution: Hyogo Medical University
• Principal Investigator: 李 知子 兵庫医科大学, 医学部, 助教 (10596042)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: デュシェンヌ型筋ジストロフィー / エクソンスキッピング治療 / スプライシング / イントロン内スプライシング制御配列 / アンチセンスオリゴヌクレオチド

Outline of Annual Research Achievements

デュシェンヌ型筋ジストロフィー(Duchenne muscular dystrophy: DMD)に対してアンチセンスオリゴヌクレオチド（As-oligo）によりエクソンスキッピングを誘導する治療が注目されている。エクソン内スプライシング制御配列を標的とし、スプライシングを変化させる治療であり、近年世界各国で治験が進められている。しかし、明確な臨床効果を示すには至っておらず、治療効果を増強する新たな戦略の開発が急務となっている。研究代表者らは、多数のDMD症例の遺伝子解析を実施してきた中で、ジストロフィン遺伝子内において、イントロン内にスプライシングを制御し得る配列があることを明らかにした。さらに、これまでのエクソンスキッピング治療研究の中で、スキッピング効率が症例によって異なり、その差異がESE以外のイントロン内スプライシング制御部位に由来する可能性を見出した。これらのことより、研究代表者らは、DMDに対する治療においても、イントロン内スプライシング制御配列を同定し、AS-oligoにより抑制することで、生体内でより効果的にスプライシングを制御し得る可能性に着想した。2018年度は、DMD症例のゲノムDNAを用いて欠失変異の解析を行うとともに、mRNAを解析し、スプライシング異常を同定した。これらの症例における欠失断端などイントロンの塩基配列をPCR法、およびダイレクトシークエンス法により詳細な解析をし、イントロン内スプライシング制御配列を同定する予定である。さらにDMD患者由来培養筋細胞mRNAにおいて、DMD遺伝子のISEをAS-oligoを用いて抑制し、スプライシングの変化を検証する。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

DMD症例のゲノムの欠失変異の解析を行うとともに、mRNAを解析し、スプライシング異常を同定した。さらに、これらの症例において欠失断端イントロンの塩基配列をPCR法、およびダイレクトシークエンス法を用いた詳細な解析にとりかかっている。

Strategy for Future Research Activity

１）欠失断端などイントロンの塩基配列をPCR法、およびダイレクトシークエンス法により詳細に解析していくことにより、イントロン内スプライシング制御配列を同定する。
２）DMD患者由来培養筋細胞mRNAにおいて、DMD遺伝子のISEをAS-oligoを用いて抑制し、スプライシングの変化を検証する。
3）DMD患者由来培養筋細胞において、DMD遺伝子のESEおよびISEの両方をAS-oligoを用いて抑制することによる、スプライシングの変化およびジストロフィン蛋白発現の増加を検証する。

Causes of Carryover

（理由）
試薬を予定よりも安価に購入できたため、未使用額が生じた。
（使用計画）
次年度の試薬の購入なども研究費にあてる予定である。