2018 Fiscal Year Research-status Report

着床前胚の細胞運命決定におけるBETファミリータンパク質を介した転写制御機構

Research Project

Project/Area Number	18K15738
Research Institution	Osama Woman's and Children's Hospital
Principal Investigator	爪麻美地方独立行政法人大阪府立病院機構大阪母子医療センター(研究所), 病因病態部門, 研究技術員 (70711026)
Project Period (FY)	2018-04-01 – 2022-03-31
Keywords	マウス / 着床前胚 / エピブラスト / BETファミリータンパク質
Outline of Annual Research Achievements	哺乳動物の着床前胚である胚盤胞は、栄養外胚葉・エピブラスト・原始内胚葉の3種の細胞群で構成される。これらの細胞群の運命決定には、各細胞種に特異的な転写因子（Cdx2, Oct3/4, Nanog, Gata6など）の発現量が、適切に制御されることが重要となる。BETファミリータンパク質（BET）は、ブロモドメインを介してヒストンのアセチル化修飾（H4K5ac, H4K12acなど）に特異的に結合し、転写を制御することが知られている。そこで、本研究では、着床前胚の細胞運命決定期にユビキタスな発現を示すBETがどのような遺伝子発現制御を行うかについて解明することを目的とした。我々のこれまでの研究では、マウス胚盤胞をBETの機能阻害剤で処理した場合、エピブラスト系譜で発現するNanogの転写低下が見られた一方で、他の細胞系譜に影響は見られなかった。さらに網羅的な解析から、BETの機能阻害で発現低下する遺伝子群は、JAK/STATシグナル経路と関連するとの示唆を得ていた。そこで平成30年度は、以下の実験を進め、結果を得た。(1)BETにより発現制御を受ける遺伝子群はJAK/STAT経路と関係しているかを調べた。マウス胚盤胞をBET阻害剤とJAK/STAT経路の活性化剤および阻害剤を組み合わせて処理し、下流マーカーの発現解析を行った。その結果、BET阻害剤処理でリン酸化STAT3の発現低下が見られ、BETはSTAT3が核内で安定的に働くために必要であることが示唆された。(2)BETの機能阻害剤で失われた転写機能は、Brd2とBrd4のどちらが担っているかを調べるために、Brd2およびBrd4ノックアウトマウスを用いて、標的遺伝子の発現をin situ hybridization法により調べた。その結果、Brd2ではなくBrd4が主に標的遺伝子の活性化に働いていることを明らかにした。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 今年度の研究計画で予定していた通り、BETとJAK/STAT経路が実際に関連していることを明らかにすることができた。また、Brd2とBrd4のノックアウトマウスを用いた解析も進めることができた。これらは当初の計画通りに行われており、おおむね順調に進展していると言える。
Strategy for Future Research Activity	マウス着床前胚の細胞運命決定期において、BETを介して転写制御されている遺伝子群はJAK/STAT経路と関与しているかについて、より詳細な解析を進める。まず、BETとSTAT3の関係性を明らかにするために、以下の実験を行う。最初に、CAGプロモーターにSTAT3の恒常的活性化型を連結したコンストラクションを作製し、マウス胚盤胞へエレクトロポレーションしてSTAT3を恒常的に発現・活性化させる。その状態に、さらにBET機能阻害剤を加えて胚を培養し、リン酸化STAT3の発現やNanogなどの下流標的遺伝子の発現が、どのように変化するかを解析する。個体を用いての実験が上手くいかない場合も考慮して、P19やESなどの培養細胞を用いたSTAT3恒常的活性化の系も検討する。さらに、BETの機能阻害剤処理で発現変動する遺伝子群とJAK/STAT経路の阻害剤処理で発現変動する遺伝子群について網羅的な解析を行い、両者にどのような関係性があるかについて調べる。具体的には、BET機能阻害剤で処理した胚盤胞、JAK/STAT経路阻害剤（Stattic, JAK inhibitorなど）で処理した胚盤胞、およびDMSO処理した胚盤胞（コントロール）を、それぞれサンプリングし、RNAシークエンスを行い、発現変動する遺伝子群について網羅的に比較・解析する。
Causes of Carryover	実験に用いたいくつかの試薬やディスポーザブル製品（解剖用ディッシュなど）は効率的に使用することができたため、次年度利用額が生じた。次年度は引き続き、マウス購入費、阻害剤試薬、生化学・分子生物学試薬、抗体などの組織学用試薬およびディスポーザブル製品購入費に加えて、細胞培養用試薬、RNAシークエンス受託費、成果発表のための旅費、等に使用する予定である。