バレット食道および腺癌発生におけるNotchシグナルとmicroRNAの機能解析

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K15751
• Research Institution: Shimane University
• Principal Investigator: 玉川 祐司 島根大学, 学術研究院医学・看護学系, 助教 (20609341)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: バレット食道 / バレット食道腺癌 / Notchシグナル / microRNA

Outline of Annual Research Achievements

バレット食道および腺癌発生におけるNotchシグナルとmicroRNAファミリーの1つであるmiR-200 familyの関連については明らかとなっていない。そこで、食道扁平上皮の恒常性維持におけるNotchシグナルとmiR-200 familyの機能解析を行うと共に、バレット食道およびバレット食道を発生母地とした腺癌の発症機構におけるNotchシグナルとmiR-200 familyの関与の詳細を解明することを目的とし、今年度は以下の研究実績を得た。
1.食道扁平上皮におけるNotchシグナルとmiR-200 familyの発現状況の解析
ヒト生検組織および手術標本を用いて、食道扁平上皮におけるNotchシグナル関連因子(Notch1, Hes1, ATOH1)とmiR-200 family(miR-200a、miR-200b、miR-429)の蛋白発現を免疫組織染色法にて検討を行なった。Notch1については食道扁平上皮の細胞質に発現を認め、Hes1については扁平上皮の核内において発現を認めたが、ATOH1については発現を認めなかった。また、miR-200 familyについては、発現亢進を認めた。
2.バレット食道・食道腺癌におけるNotchシグナルとmiR-200 familyの発現状況の解析
組織学的にバレット食道・腺癌と診断されたヒト生検組織および手術標本を用いて、Notchシグナル関連因子(前述)とmiR-200 family(前述)の蛋白発現を免疫組織染色法にて検討を行なった。バレット食道・腺癌におけるNotch1発現は食道扁平上皮と発現に差は認めず、腺癌組織において著明なHes1低下とATOH1発現亢進を認めた。また、miR-200 familyについては、発現低下を認めた。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

平成30年度の研究実施計画である“食道扁平上皮や病的状態（バレット食道おぴょび腺癌）でのNotchシグナルとmiR-200 familyの発現状況を解明する”はおおむね順調に進展している。その解析結果よりNotchシグナルとmiR-200 familyの発現パターンの違いも把握できていることからも、その相互作用について更なる検討が必要である状況と考えられる。よって、平成31年度以降の研究実施計画である“NotchシグナルとmiR-200 familyの関連についての検討”に速やかに取り組めると自己評価している。

Strategy for Future Research Activity

平成30年度に得られた結果を基にして、平成31年度以降の研究実施計画である“NotchシグナルとmiR-200 familyの関連についての検討”の実施を予定している。
①バレット食道および腺癌でのNotchシグナルの発現状況とmiR-200 familyとの関連
臨床検体を用いた検討で、上記に示したNotchシグナルの発現状況とmiR-200 familyの発現パターンから相互作用について検討する。
②miR-200 familyを発現調節した培養細胞を用いたNotchシグナルの発現解析
予備的検討にて、Het-1AではmiR-200 familyの発現亢進を認め、バレット食道および腺癌の細胞株ではmiR-200 familyの発現抑制を認めている。Het-1AにmiR-200阻害剤を用いて、miR-200 family発現を抑制した際のNotchシグナル関連因子の発現変化について検討する。さらにこのシステムにおいて、胆汁酸刺激によるNotchシグナルの発現変化も確認する。バレット食道および腺癌の細胞株にprecursor miR-200発現ベクター(構築済み)を導入し、miR-200 familyの発現状況が異なる細胞を複数作成する。上記と同様にmiR-200 familyの発現レベルの変化によるNotchシグナル関連因子の発現を確認し、これらの細胞の増殖能をMTS assayやBrdU assayを用いて評価する。さらにmigration assayやinvasion assayも行う。また、γセクレターゼ阻害薬やNotch1-siRNAによってNotchシグナルを直接抑制させた場合の状況とも比較検討する。

Causes of Carryover

結果的に平成30年度から繰り越して使用する研究費として298,843円が生じた。その原因としては、新たに購入した各種抗体、分子生物学的試薬が当初の予定より安価で購入できたことが一因であると考えられる。
平成31年度の研究費使用計画としては、本研究に関する設備・備品は整っているため、実験動物や細胞株の購入費を中心として、各種抗体、分子生物学的試薬などの消耗品に関する費用が主な研究経費となる。また、本年5月に米国サンディエゴで開催される国際学会Digestive Disease Week 2019(DDW2019)にて研究成果を発表する予定でもあり、それに関する研究成果発表旅費も必要である。