2019 Fiscal Year Research-status Report
炎症性腸疾患における異なる組織幹細胞機能の制御メカニズムの解明
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18K15759
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| Research Institution | Nagoya City University |
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Principal Investigator |
片野 敬仁 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 研究員 (50768372)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 幹細胞 / KLF |
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| Outline of Annual Research Achievements |
腸管幹細胞（Intestinal Stem Cell; ISC）は、①Lgr5を発現し、組織恒常性維持の間に多分化能性幹細胞としての機能を活発的・動的に発揮する幹細胞（active ISC）の集団と、②Bmi1などマーカーを発現し、傷害によるactive ISCの枯渇後の再生源として役立つ、休止または予備のISC（quiescent ISCまたはreserve ISC）に分類される。本研究では、粘膜傷害時におけるISCの挙動や病態形成への関与を探索することを目的し、バックアップとして作用するquiescent ISCとしてのBmi1陽性幹細胞の機能制御メカニズムを解明することを目的としている。
quiescent ISCのマーカーとしてBmi1+細胞に主眼を置き、Bmi1-CreER;Rosa26eYFPマウスを用いてBmi1＋細胞の挙動を確認した。Bmi1＋細胞はcryptのposition 4付近に存在し、Lgr5＋幹細胞に比べslow cyclingであるものの、正常状態においても一定の役割を果たしていることをしめした。蛍光免疫染色を用いてBmi1＋細胞とKLF４および増殖マーカーEdUとの関連を検討し、KLF４が正常時においてはBmi1＋細胞を静的状態に維持し、粘膜傷害時
にはBmi1＋細胞を増殖へ誘導するという相反する機能をもつことが示唆された。
また、FACSを用いて単離した小腸Bmi1-eYFP細胞からオルガノイドを樹立し、放射線傷害時における粘膜再生の過程をex vivoで再現した。Bmi1＋細胞特異的にKLF4をノックアウト可能なマウスモデルを用いて、粘膜傷害時のBmi1＋細胞の挙動とKLFファミリー、とくにKLF4の機能に主眼をおいて研究を継続する。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究の目的は、とくに転写因子であるKLF4の機能に着目して、Bmi1陽性幹細胞の組織恒常性維持および粘膜傷害時における制御機構を解明をすることである。
Bmi1-CreER;Rosa26eYFPマウスを用いて細胞系譜を行い、正常状態におけるBmi1陽性細胞の局在を確認した。また、Bmi1+細胞特異的にKlf4をノックアウト可能なマウスモデルも用い、正常時・放射線粘膜障害時におけるBmi1+細胞の挙動を細胞系譜するとともに、Bmi1＋幹細胞制御におけるKLF4の機能を解析した。また、単一のBmi1-YFP陽性細胞からのオルガノイドを用いて、ex vivoにおいて放射線傷害時の粘膜再生の過程を再現することが可能となった。
昨年度は主に正常状態におけるBmi1陽性細胞の局在と腸管上皮におけるKLF4発現の分布や、KLF4とBmi1陽性細胞、増殖マーカーとの関連を中心に解析をすすめ、本年度は放射線傷害時におけるKLF4とBmi1陽性細胞の関係を中心に解析をすすめた。オルガノイドを用いてex vivoでの放射線粘膜傷害モデルも樹立できた。
粘膜傷害時のBmi1陽性細胞とKLF4の機能解析を進めるうえで基盤となるデータ、マウスモデル・培養技術を確立できており、本研究課題の進捗状況について、おおむね順調に進展していると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後はとくに粘膜障害時におけるBmi1陽性幹細胞の挙動と、KLF4の機能解析を中心に研究を遂行する予定である。Bmi1陽性幹細胞特異的にKLF4をノックアウト可能なマウスモデルを用い、とくにそれぞれのマウスからシングルセルソーティングされたBmi1-eYFP細胞からのオルガノイドを用いて、粘膜障害時にバックアップとして作用するquiescent ISCとしてのBmi1陽性幹細胞の機能制御メカニズムを解明する。
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| Causes of Carryover |
蛍光免疫染色や各種実験に用いる試薬や培養に用いる試薬などは既存の試薬を用いることが可能であったため、当初の予定より本年度の使用額が抑えられました。次年度は引き続き、単一のBmi1-YFP陽性細胞をセルソーティングし、それから培養されたオルガノイドを用いてex vivoでの機能解析を行う予定であり、培養試薬・各種実験試薬のために次年度使用額が生じることとなりました。
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Research Products
(1 results)
