2018 Fiscal Year Research-status Report
核酸導入によるアセチルコリンエステラーゼの抗心不全作用の増強と病態制御への応用
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18K15850
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| Research Institution | Kochi University |
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Principal Investigator |
戸高 寛 高知大学, 教育研究部医療学系基礎医学部門, 助教 (80769662)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 虚血性心疾患 / アセチルコリンエステラーゼ / アセチルコリン / 心筋細胞 / 虚血 / 再灌流障害 / AChE-R |
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| Outline of Annual Research Achievements |
アセチルコリンエステラーゼ（AChE）はアセチルコリンを分解する酵素としての機能が広く知られているが、近年、神経伝達に関与しない組織や細胞でも発現していることが発見され、その機能の再考が求められている。申請者はAChEスプライシングバリアントのひとつであるReadthrough-AChE（AChE-R）の心臓における発現を見出し、虚血ストレスに応じた心臓AChE-Rの発現上昇を確認している。AChE-Rは抗アポトーシス作用および抗炎症作用を有することが報告されていることから、心臓AChE-Rの発現増加は虚血障害から心筋細胞を保護している可能性が示唆された。本研究では、AChE-Rの心筋保護作用の分子機序の解明とAChE-Rの心筋保護作用の増強による虚血性心疾患の制御を目的とした。まず、心臓AChE-Rの心筋保護作用の分子機序を解明するため、AChE-R過剰発現系の構築を行った。その結果、安定型AChE-R発現細胞株の樹立に成功した。次に、これらの細胞株を用いて虚血ストレス条件下で培養を行い、細胞の生存率を測定した。その結果、AChE-R発現細胞株はコントロール細胞株と比べ、虚血ストレスに対する生存率が高くなることが明らかとなった。また、AChE-Rのタンパク質レベルの解析を可能にするためAChE-Rのみを検出するAChE-R特異的抗体の作製を行い、その作製に成功した。加えて、生体におけるAChE-Rの抗心不全効果を明らかとするため、マウスの心臓特異的AChE-R発現系の構築を行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度は、心臓AChE-Rの機能解析に重要なAChE-R過剰発現系の構築、および、AChE-Rのタンパク質レベルの解析に必要なAChE-R特異的抗体の作製に取り組んだ。その結果、AChE-R過剰発現系の構築および安定型AChE-R発現細胞株の樹立に成功、AChE-Rのみを検出する抗体の作製に成功した。これらを用いて、虚血ストレス条件下で安定型AChE-R発現細胞株を培養するとコントロール細胞株に比べ、細胞の生存率が上昇することが明らかとなった。この結果より、心臓AChE-Rは虚血ストレスに対して抵抗性を示すことが示唆された。
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| Strategy for Future Research Activity |
AChE-R発現細胞株の虚血ストレス条件下の培養で細胞の生存率が上昇する分子機構を解明するため、以下の解析を行う。虚血ストレス条件下におけるAChE-R発現細胞株の①アポトーシス測定（TUNEL染色、Caspase assay）、②エネルギー代謝に関わる分子の機能解析（グルコース取り込み速度の測定）、③サイトカインおよびケモカイン産生量の測定（ELISA、RT-PCR）を行う。またマウスの心臓特異的なAChE-R発現系の構築を行い、生体レベルでのAChE-Rの機能を明らかにする予定である。これにより、虚血性心疾患におけるAChE-Rの心筋保護作用の全貌を明らかにできると考えている。
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| Causes of Carryover |
安定型AChE-R発現細胞株の樹立およびAChE-R特異的抗体の作製に必要な試薬や消耗品は、教室現有のものを使用したため研究費の削減につながった。本年度は、虚血性心疾患モデル作製用動物の購入費、細胞培養に必要な消耗品の購入費、生化学的解析に必要な各種抗体やELISAキット、RT-PCRキットやmicroarray、遺伝子やタンパク質の単離・精製キット等の購入費としての使用を計画している。
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