Mtus1遺伝子による 心肥大抑制機構の解明とその臨床応用

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K15873
• Research Institution: National Cardiovascular Center Research Institute
• Principal Investigator: 伊藤 慎 国立研究開発法人国立循環器病研究センター, 臨床研究開発部, 室長 (20796560)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: 心肥大 / 遺伝子解析

Outline of Annual Research Achievements

１．Mtus1バリアントの発現制御解析
Mtus1の3つのバリアント（Mtus1A, B, C）は、5 prime側が特異的な配列を持ち、3 prime側は一部配列が共通していることから、バリアントの発現は異なる転写因子により制御されていると考えられた。そこで、心肥大に関与する転写因子として知られているc-Myc, GATA4, TBP, MEF2をアデノウイルスベクターにより、仔ラット心筋細胞に強制発現させた。その結果、c-Mycの強制発現によりMtus1Aの発現増加がみられ、c-MycがMtus1Aの転写因子として働いていることがわかった。しかし、Mtus1B, Mtus1Cの発現に変化は見れなかった。
２．ヒト心筋症サンプルを用いたMtus1A蛋白の発現解析
予備実験として、我々が既に作成しているMtus1バリアントを特異的に検出する抗体を用い、仔ラット心筋細胞でタンパク発現解析を行った。バリアントをそれぞれアデノウイルスベクターで強制発現させたところ、Mtus1Aはミトコンドリア、Mtus1Bは核膜、Mtus1Cは微小管と、局在が異なることを明らかにした。心肥大モデルマウスを用いた組織学的検討では、心筋においてMtus1Aが増加していることがわかった。
我々は、拡張型心筋症患者よりバチスタ手術の際に取り出された心臓から、cDNAを取り出し保管している。このサンプルは、個人情報保護法改訂前に取得され、すでに匿名化され個人を特定できないものである。このサンプルを用いて、RT-PCRにてMtus1Aの発現を調べたところ、正常心と比較し、Mtus1Aは多いもので1.8倍に増加していたが、減少しているサンプルもあった。Mtus1Aの発現解析や機能解析には、臨床背景や心機能の評価を合わせて考えることが重要であることがわかり、ヒトサンプルを用いた実験を行うため、研究計画書を作成している。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

Mtus1バリアントの発現制御解析では、Mtus1Aの発現はc-Mycが転写因子として働いていることを明らかにした。直接制御していることを明らかにするため、さらなる検討が必要と考えられるが、ターゲットを絞ることができ、進捗はおおむね順調である。
ヒト心筋症を用いたMtus1Aの発現解析では、Mtus1バリアントの細胞内局在を明らかにし、心肥大モデルマウスにてMtus1Aが心筋組織において有意に増加していることを明らかにした。この発現は、血管平滑筋、内膜、線維巣では見られず心筋特異的なものであった。また、拡張型心筋症のサンプルを用いた遺伝子発現の解析も行った。これらの予備実験より、ヒトサンプルの解析に繋がる知見が得られた。拡張型心筋症および肥大型心筋症のサンプルを用いた免疫染色や変異解析を行うため、研究計画書を作成中であり、次年度に実施予定であり、進捗はおおむね順調である。ダイレクトシークエンス法にて遺伝子解析を行うため、プライマーの作成を完了した。

Strategy for Future Research Activity

転写因子の解析では、Mtus1のプロモーター領域のメチル化解析やクロマチン免疫沈降アッセイにより、c-MycがMtus1の転写因子として働くことを明らかにする。ヒトサンプルを用いた解析は、研究計画書を作成後、倫理委員会に申請し、承認された後に開始する。具体的には、心筋生検や剖検が行われた拡張型心筋症患者、肥大型心筋症患者を病理のデータベースより抽出する。その後、患者背景や心機能などに関する臨床情報を取得し、心筋組織でのMtus1A発現との相関を検討する。また、同じ患者から取得した血液サンプルよりDNAを抽出し、今回作成したプライマーを使用し、遺伝子変異解析を行う予定である。

Causes of Carryover

今年度、転写因子同定のために行う予定であったクロマチン免疫沈降アッセイが施行できなかった。次年度に解析を行うため、残余金額を使用予定である。