Research project for SCN5A dominant-negative mechanism

2019 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 18K15887
• Research Institution: Shiga University of Medical Science
• Principal Investigator: 加藤 浩一 滋賀医科大学, 医学部, 助教 (70736983)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: ブルガダ症候群 / SCN5A / ドミナントネガティブ効果

Outline of Annual Research Achievements

本研究の進行中に、新たに特発性心室細動の家系にSCN5A-A364Gの遺伝子変異を同定した。本研究の対象となるD356N F355Iの2変異の近傍に位置する変異であることから、この変異も解析対象に含めて実験を進めることとした。また、Naチャネル分子2分子が結合することを実証したClatotらの報告で、S460A変異をSCN5Aに組み込むとこの結合が解除されドミナントネガティブ効果がキャンセルされるという現象が観察されたため、このS460Aの変異体も新たに用意することとなった。
・変異プラスミド作成：新たに同定したSCN5A-A364Gと、SCN5A-S460Aの変異プラスミドは作成に成功した。
・ビオチン法・ウエスタンブロットによる細胞膜へのチャネル発現レベルの比較：現在D356NとF355Iのビオチン法によるチャネル発現比較実験は完了した。この変異によるNav1.5チャネルの細胞膜発現への影響は乏しいことが確認された。引き続きA364Gの変異についても確認を進めていく。
・成熟（糖鎖修飾後）Naチャネルの発現量の比較：今回我々が実施したウエスタンブロット法では、成熟Naチャネルのバンドと未成熟Naチャネルのバンドははっきりと分離されず、これらを別個に評価することは困難であった。泳動条件を種々に変化させて再検しているが、現在のところ安定した結果を得ることができずにいる。
・電気生理学実験：培養細胞を用いた電流解析は、F355I単独、D356N単独、野生型＋F355I, 野生型＋D356N,の4つのコンディションで終了しており、D356Nでは見られなかったドミナントネガティブ効果がF355Iでは明らかに観察された。 A364G単独、野生型＋A364Gのパッチクランプ解析も同様に行い、続いて野生型をS460Aの変異体で置き換えた場合についても観察を行う。