2019 Fiscal Year Annual Research Report
New drug development for metabolic syndrome via WNK4 singnaling analysis
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18K15970
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| Research Institution | Tokyo Medical and Dental University |
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Principal Investigator |
磯部 清志 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 寄附講座助教 (80804591)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 脂肪分化 / WNK４ / メタボリックシンドローム / PPARγ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
１．3T3-L1細胞とmpkDCT細胞を使用したWNK KO細胞の作成
我々が作成したWNK4ノックアウト(KO)マウスの解析では、脂肪細胞分化抑制、耐糖能の維持という表現系が観察された。WNK4を制御することが肥満や高血圧の治療につながっていくことが期待される。WNK4がどのように肥満と関連しているかを解明するため、WNK4ノックアウト細胞をCRISPR-Cas9を用いて作成した。GFP発現CRISPR-Cas9ベクターをそれぞれの細胞にトランスフェクションし、GFPを発現している細胞をFACSによりsingle cell sortingを行った。培養後、Western blottingにてWNK4の蛋白発現量を調べた。その結果、3T3-L1細胞で５クローン、mpkDCT細胞で６クローンの培養細胞ラインを得ることができた。
２．WNK4 KO細胞の形質の評価
得られたWNK4ノックアウト細胞の形質の評価を行う前に、single cell sortingによるartifact effectを確認した。mpkDCT細胞ではWNK4の発現量やその下流であるSPAKのリン酸化に影響は認められなかった。一方、3T3-L1は脂肪分化やPPARγの発現量にSingle化したクローン毎にばらつきが認められたため、WNK4 KOによる影響かどうかは複数のクローンを使用するなどして慎重に評価する必要があると考えられた。
WNK4が活性化する低浸透圧刺激で下流のSPAKのリン酸化も増加する。WNK4 KOマウスではSPAKのリン酸化は著明に減少していた。mpkDCTでのWNK4 KO細胞では、下流のSPAKのリン酸化は低浸透圧刺激に反応してリン酸化の増加が認められた。培養細胞はマウスとは異なる形質を示していた。３T３に関してはPPARγおよびC/EBPαの発現がWNK４KOで減少していた。
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