2019 Fiscal Year Research-status Report
Elucidation of the FKBP12 function in glomerular epitheial cells
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18K15996
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| Research Institution | Niigata University |
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Principal Investigator |
安田 英紀 新潟大学, 医歯学系, 助教 (00806490)
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2018-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | ネフローゼ症候群 / FKBP12 / 糸球体上皮細胞 / タクロリムス / カルシニューリン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本年度は、カルシニューリン関連分子群の発現と伴に、特に重点的にFKBP12とシクロフィリンA(CyPA)の発現と局在の差を明らかにする為にラットの腎臓と単離糸球体、ヒト培養ポドサイトを用いてRT-PCR、Western blot、免疫染色による解析を行った。FKBP12は腎臓内では糸球体と一部の尿細管で発現するが、CyPAは糸球体と尿細管で明瞭に発現し、尿細管におけるCyPA発現はFKBP12に比べて高い事を明らかにした。また、糸球体内の各細胞のマーカー分子とポドサイト関連分子群との二重染色によって、糸球体内でFKBP12はポドサイトに限局し、細胞質足突起に局在するが、CyPAはポドサイトとメサンギウム細胞の一部に発現し、ポドサイトの基底部膜近傍に多く発現する事を明らかにした。培養ポドサイトではFKBP12とCyPAは細胞質とアクチン細胞骨格近傍に発現するが、アクチン細胞骨格近傍におけるFKBP12発現はCyPAに比べて高い事を明らかにした。
アドリアマイシン(ADR)によって誘導された巣状糸球体硬化症(FSGS)モデルと培養ポドサイトの傷害モデルにおけるFKBP12とCyPA発現、これらのモデルに対するタクロリムス(Tac)治療のFKBP12発現への影響とポドサイト保護効果を同様の方法で解析した。FSGSモデルと培養ポドサイトの傷害モデルでFKBP12発現は低下したが、CyPA発現は変化しなかった。Tac治療によってこれらのポドサイト傷害モデルにおけるFKBP12発現は保持され、ポドサイト傷害が軽減した。
これらの結果から、TacとシクロスポリンA(CsA)はポドサイトにおいて細胞骨格近傍で作用すると考えられるが、Tacはより選択的にポドサイトに作用する事が示された。また、Tacは細胞骨格近傍のFKBP12を保持する事でポドサイト傷害を軽減する効果を持つ事が示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度は、正常な腎臓におけるFKBP12とCyPAの発現と局在の差を検討した。また、ポドサイト傷害モデルにおけるFKBP12とCyPA発現、これらの発現に対するTac治療の影響とポドサイト保護効果を解析した。
正常な腎臓でFKBP12 mRNA発現は皮質、髄質に比べて単離糸球体で高かったが、CyPA mRNAは同等の発現を示した。免疫染色でもFKBP12は糸球体で明瞭に発現し、一部の尿細管でも弱い発現が見られた。CyPAは糸球体と尿細管で発現し、尿細管のCyPA発現はFKBP12より強かった。糸球体内でFKBP12はポドサイトに限局して発現するが、CyPAはポドサイトとメサンギウム細胞の一部で発現する事を示した。ポドサイトではFKBP12は細胞質足突起に、CyPAは基底部膜近傍に多く局在していた。更に、ヒト培養ポドサイトにおける免疫染色によってFKBP12とCyPAはF-actin近傍に発現し、F-actin近傍のFKBP12発現はCyPAより強い事を明らかにした。
FSGSモデルの糸球体でFKBP12とNephrinの発現は低下したが、CyPAは変化しなかった。Tac治療によってこのFKBP12とNephrinの発現低下は軽減された。また、ADRによって傷害された培養ポドサイトではF-actinの染色性とFKBP12発現は低下したが、CyPAは変化しなかった。Tac治療によってこれらのポドサイトのF-actin近傍のFKBP12発現は保持され、F-actinの染色性低下が軽減される事を示した。
以上の所見から、TacとCsAはポドサイトの細胞骨格近傍で作用し、Tacはより選択的にポドサイトに作用する可能性が示された。また、Tacが細胞骨格近傍のFKBP12を保持する事でポドサイト傷害を軽減する効果を持つ事を示したため、本研究課題は当初の計画通り順調に進展していると考えた。
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| Strategy for Future Research Activity |
培養ポドサイトにおけるFKBP12とF-actinの相互作用をActin binding assayによって解析する。また、細胞表層、細胞質内部、核周囲の各分画の可溶化材料を用いたWestern blotによってFKBP12およびCyPAと既知の14-3-3βやCortactinなどのアクチン結合蛋白質の細胞内局在を比較検討する。
次に、培養ポドサイトのFKBP12の発現と細胞内局在に対するTac添加の影響を検討する。具体的にはTac添加の培養ポドサイトにおけるFKBP12発現をリアルタイムPCR、Western blot、免疫染色によって解析し、細胞表層、細胞質内部、核周囲の各分画の可溶化材料を用いたWestern blotによってFKBP12の細胞内局在に対するTac添加の影響を検討する。
更に、培養ポドサイトに対するsiRNAによるFKBP12ノックダウンの影響を検討する。具体的には、siRNA処置した培養ポドサイトでリアルタイムPCR、Western blot、免疫染色によってFKBP12のノックダウン効率を確認し、細胞の形態とアクチン細胞骨格への影響をF-actin染色によって解析する。
また、FKBP12ノックダウンの培養ポドサイトにおけるアクチン関連分子群とポドサイト関連分子群の発現の変化をリアルタイムPCR、Western blot、免疫染色によって解析し、アクチン細胞骨格の維持におけるFKBP12の機能と関連性のある分子を検討する。FKBP12ノックダウンで発現に変化が認められた分子とFKBP12の正常糸球体と培養ポドサイトにおける局在を免疫染色によって確認し、その分子とFKBP12を強制発現させたHEK細胞で免疫沈降法によって相互作用を解析する。
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| Causes of Carryover |
解析に必要なCyPA抗体、培養ポドサイトに対するADRの添加条件、Tacの添加条件の確立が当初の計画より順調に達成されたため。
研究課題を更に進展させた解析の為に、siRNA、Actin binding assay kit、抗体などの購入に使用する。
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