2019 Fiscal Year Research-status Report

ポドシンのエンドサイトーシスにおけるSNX9およびNPC2の役割

Research Project

Project/Area Number	18K16008
Research Institution	Juntendo University
Principal Investigator	佐々木有順天堂大学, 医学部, 助教 (10790082)
Project Period (FY)	2018-04-01 – 2021-03-31
Keywords	糸球体硬化 / ポドシン / エンドサイトーシス / SNX9 / NPC2 / NEFH / シナプトポディン
Outline of Annual Research Achievements	本研究は糸球体足細胞（ポドサイト）の障害機序を明らかにすることを目的としており、本年度はSNX9の過剰発現モデルを作成し、NPC2とポドシンの相互作用について検討後に足細胞特異的なSNX9ノックアウトマウスを作成する予定であった。我々はポドサイト障害の機構を解明するため、アドリアマイシン(ADR)誘発腎炎モデルマウスを用いた。ADR誘発腎炎では、蛋白尿に伴って足突起の融合、ポドサイトの特異的なマーカーであるネフリン・ポドシン・シナプトポディンなどの発現量の減少、アポートシスが認められることが報告されている。我々はポドサイト障害に関連する遺伝子を明らかにするために、正常ポドサイトとADR誘発障害ポドサイトからRNAを抽出し、マイクロアレイアッセイを行い比較検討した。その結果、ADR誘発障害時に発現が著しく増加するneurofilament heavy polypeptide(NEFH)を同定した。 NEFHはADR誘発腎炎モデルマウスと培養ポドサイトにおいて発現が亢進しており、免疫染色および免疫沈降でポドサイト特異的蛋白であるシナプトポディンと共発現していることを証明した。さらにNEFHを強発現させた培養ポドサイトではADR投与によるシナプトポディンの発現低下が抑制されていることに注目した。NEFHノックダウンにより細胞接着に関与するビンキュリンの発現が低下し、細胞外マトリックスへの接着性が低下しポドサイトの脱落がみられた。ネフローゼを呈する糸球体腎炎は微小変化群に認める可逆的変化から、巣状糸球体硬化症に認める不可逆的な変化を引き起こすものまで多彩である。可逆的病態でNEFHの発現は弱かったが不可逆的病態においては強く発現していた。NEFHはポドサイト障害時に発現し、シナプトポディンの発現低下とポドサイトの脱落を防ぎ腎保護作用を有していることを論文化した。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 糸球体足細胞とその足突起間に存在するスリット膜と呼ばれる構造が蛋白尿と密接に関連する濾過障壁機構であるが、スリット膜の足細胞突起側には、ポドシンをはじめとする蛋白質が集積して複合体を形成し、足細胞内でCD2AP等のアダプタータンパク質を介してアクチン細胞骨格と連結している。我々の研究によりポドシンは足細胞障害時に細胞膜からエンドソーム内へ局在変化することが明らかとなったが、その後リソソームへと運ばれ分解されるか、あるいはリサイクリングエンドソームにより細胞膜へ戻るかについては解明できていない。今回我々はNEFHがポドサイトの細胞骨格を形成する蛋白であるシナプトポディンの分解やポドサイト脱落を抑制することによりポドサイト障害を防ぐことを解明し、足細胞障害の機序の一端を明らかにすることができた。シナプトポディンはアクチン骨格制御や血液濾過の維持に重要な役割を果たしており、足細胞障害時におけるポドシンのエンドサイトーシス経路解明にも有益と考えられた。
Strategy for Future Research Activity	これまでに得られた結果を元に、SNX9の過剰発現モデルを作成し培養足細胞におけるSNX9の役割を解析し、足細胞特異的なSNX9 knock out マウスを作成し、足細胞におけるSNX9の役割を解明する。正常状態での様子をスリット膜関連蛋白質、足細胞骨格形成の蛋白質、エンドサイトーシス関連蛋白質との発現を蛍光免疫染色とWestern Blot法において解析する。さらにアドリアマイシン投与により糸球体硬化を誘発し、上記蛋白質の動態を評価する予定である。またNPC2に関しては、ヒト腎生検およびマウスの実験モデルにて進行性糸球体腎炎モデルにおけるNPC2の局在・発現量を確認後に、培養足細胞において正常時と障害時での蛋白質の量・局在・機能を確認する。さらに標的蛋白質のsiRNA法によるknock downを行い、培養足細胞でのNPC2の発現抑制モデルの作成を行い、スリット膜関連蛋白質、足細胞骨格形成の蛋白質、エンドサイトーシス関連蛋白質との発現を解析する。さらにアドリアマイシン投与により糸球体硬化を誘発し、上記蛋白質の動態を評価する。本研究でえられた結果は、学内の研究協力者と適宜討論を行い、研究成果を学会、欧米紙等に随時発表していくことを考えている。
Causes of Carryover	当初の計画よりも実験がやや遅れているため、予定よりも物品費用が少なかったため。次年度は実験計画に沿って使用予定である。