2018 Fiscal Year Research-status Report
DCML欠損症発症に寄与するGATA2によるB細胞分化制御機構
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18K16074
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| Research Institution | Tohoku University |
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Principal Investigator |
長谷川 敦史 東北大学, 事業支援機構, 助教 (80747460)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | GATA2 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
GATA2は造血幹細胞の産生と機能維持に必須の転写因子であるが、DCML欠損症に代表される免疫細胞産生異常症患者において遺伝子変異が多数見つかっており、これまで不明な点が多かった血球運命決定・分化誘導における役割が強く示唆されている。本研究では、免疫担当細胞の分化制御におけるGATA2の役割と、その破綻による疾患発症メカニズムを明らかにすることを目的とし、ゲノム編集により樹立したGata2R398W/+マウスにおける血液学的表現型の解析をおこなった。
本マウスは生後3ヶ月齢程度の若齢期では顕著な血液学的異常を呈さないが、5ヶ月齢以降より末梢白血球の有意な減少を認めた。フローサイトメトリーを利用した末梢白血球中の血球分布解析より、B細胞、NK細胞、樹状細胞、および単球の有意な減少を認め、ヒトDCML欠損症と非常に類似した特徴的な表現型を呈することが明らかとなった。またGATA2R398W変異体は転写活性化能およびDNA結合能が減弱していることがわかった。さらに興味深いことに、野生型GATA2とGATA2R398W変異体が共存している条件下では、野生型GATA2の転写活性化能およびDNA結合能が強く阻害されること、またこれらの阻害作用は２つのGATA結合配列が連続で並ぶTandem-GATAモチーフ上において特異的に認められることがわかった。
以上の結果は、Gata2変異が見つかっているヒトDCML欠損症患者と同様のヘテロ接合変異が疾患発症に強く寄与すること、またTandem-GATAモチーフに依存する標的遺伝子の特異的な制御破綻が、表現型につながる遺伝子発現異常を惹起している可能性を示唆するものである。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ゲノム編集により樹立したGata2R398W/+マウスにおいて、GATA2の機能不均衡に起因する血液学的表現型を解析した。末梢血血算値より、本マウスは生後3ヶ月齢程度の若齢期では顕著な血液学的異常を呈さないが、5ヶ月齢以降より末梢白血球の有意な減少を認めた。フローサイトメトリーを利用した末梢白血球中の血球分布解析より、B細胞、NK細胞、樹状細胞、および単球の有意な減少を認め、ヒトDCML欠損症と非常に類似した特徴的な表現型を呈することが明らかとなった。また12ヶ月齢程度の老齢期までの観察では、白血病の発症に至る個体は得られないことがわかった。
変異に起因するGATA2タンパク質機能欠損を分子レベルで解析するために、GATA結合配列を制御領域としたルシフェラーゼ遺伝子を用いたレポーター解析を行った。HEK293T細胞にレポーター構築およびGATA2発現構築を導入することで、GATA2R398W変異体における転写活性化能の低下を見出した。また、２つのGATA結合配列が連続したTandem-GATAモチーフを制御領域に持つルシフェラーゼレポーターでは、野生型GATA2とGATA2変異体を共発現させた際に、野生型GATA2の転写活性化能をGATA2変異体が競合的に阻害することを明らかにした。さらに、表面プラズモン共鳴法によるDNA結合親和性解析から、Tandem-GATAモチーフへの野生型GATA2の結合を、共存するGATA2変異体が阻害することを明らかにした。
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| Strategy for Future Research Activity |
Gata2R398W/+マウスは、ヒトDCML欠損症と非常に類似した特徴的な表現型を呈することが明らかとなったが、GATA2の変異によりどのような標的遺伝子の発現制御が損なわれるかは不明である。まずGata2R398W/+マウスの造血幹細胞分画を、セルソーターを用いて単離し、網羅的遺伝子発現解析により発現変動を示す遺伝子を探索する。抽出した候補遺伝子の発現変動を定量RT-PCRにて検証するとともに、発現制御領域を用いてルシフェラーゼレポーター解析を行い、GATA2の標的遺伝子であること、およびGATA2変異による直接的な発現制御破綻が生じることを明らかにする。また、ヒト血球系培養細胞株（K562）を用い、内在GATA2と同時にGATA2変異体を外来性に発現させた条件下で、網羅的遺伝子発現解析を行う。これにより、ヒト血球系細胞においても、野生型GATA2とGATA2変異体が共存することでGATA2標的遺伝子の発現変動が起こることを検証する。
またB細胞の顕著な産生異常が認められたことから、これまで知られてなかったB細胞分化過程におけるGATA2の新たな役割を解明するための解析を行う。Gata2R398W/+マウスの骨髄を用い、コロニーアッセイおよびFACSでのB細胞分化段階の追跡により、分化障害を受けているステージの細胞を同定する。同細胞において、アポトーシスの程度を解析するとともに、セルソーターによる単離の後に網羅的遺伝子発現解析を行うことで、分化異常のメカニズムとして細胞生存性および遺伝子発現の変化を明らかにする。
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| Causes of Carryover |
当該年度中の実験に使用する物品について、研究開始時点で用意していたものと新規購入品とを合わせることで十分な量を確保することができた。また研究の進捗具合と試薬等の使用期限を考慮すると、大容量品やストックを購入することができなかったため、繰越が発生した。
次年度使用額分の使途として、フローサイトメトリー解析に用いる試薬、抗体類の購入費用とする。また、細胞培養実験と遺伝子発現解析のための試薬物品類の購入費用とする。
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