2018 Fiscal Year Research-status Report
赤血球造血における血小板活性化受容体CLEC-2の役割の解明
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18K16080
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| Research Institution | University of Yamanashi |
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Principal Investigator |
大竹 志門 山梨大学, 大学院総合研究部, 助教 (50813060)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | CLEC-2 / 赤血球造血 / 巨核球 / 骨髄微小環境 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
我々は血小板活性化受容体CLEC-2を同定し，CLEC-2巨核球血小板特異的ノックアウト（CLEC-2 cKO）マウスが，血小板減少と貧血をきたすことを見出した．CLEC-2が巨核球造血に果たす役割については，巨核球と，CLEC-2の生体内リガンドであるポドプラニンを発現する間質細胞が骨髄微小環境を形成し，巨核球造血を正に制御していることを報告したものの，赤血球造血に及ぼす影響について報告はない．
そこで，CLEC-2 cKOマウスより骨髄細胞を採取し，赤芽球の各分化段階割合を評価したところ，好塩基性赤芽球以降の分化段階にあたるTER119陽性分画が優位に減少していた．
さらに解析を進めたところ，この分画においてアポトーシス細胞割合が有意に増加していた．また，CD71陽性赤芽球における細胞周期に変化は認めない一方，未熟なBFU-Eでは，G0/G1期細胞割合が減少，S期細胞割合が増加した．
巨核球とPDPN発現間質細胞が赤芽球造血を制御している可能性を考え，In vitroにおけるPDPN発現間質細胞の培養を試みた．まず，骨髄細胞をディッシュに播種した後，培地を連日交換することで接着細胞を培養した．これらの一部にポドプラニンの発現を認めた．これらの細胞にCLEC-2-Fc融合蛋白またはFc蛋白を加え，48時間後に回収した．馴化培地をサイトカインアレイで解析した結果，前者において，βケモカインおよびIL-6が増加した．
胎児肝より幼若赤芽球を分取し，増加を認めたサイトカイン・ケモカインを添加したところ，IL-6のみが赤芽球の生存率を有意に高く保った．しかし，血清・骨髄細胞外液IL-6濃度はELISA法でいずれも検出限界未満で，野生型マウスに対するIL-6抗体投与も貧血を誘導できなかったことから，定常状態におけるIL-6の関与をマウス生体内で論証するには至っていない．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
貧血および血小板減少を呈するCLEC-2 cKOマウスを使用し，骨髄微小環境におけるCLEC-2の役割を検証した．
CLEC-2 cKOマウス骨髄において，赤芽球のアポトーシス細胞割合が増加し，成熟した細胞割合が減少したことが，CLEC-2 cKOマウスの呈する貧血の原因になっていると考えられた．骨髄微小環境に何らかの変化が生じていることを想定し，一部がCLEC-2のリガンドであるポドプラニンを発現する骨髄間質細胞を培養し，リコンビナントCLEC-2を加えて刺激したところ，in vitroにおいて赤芽球のアポトーシスを抑制するIL-6が分泌されていた．
In vitroにおいては，IL-6が未熟な赤芽球の分化を促進する報告はあるものの，in vivoにおいてIL-6を中和しても貧血は誘導されず，骨髄中・血清中におけるIL-6濃度も変化を認めなかった．さらにin vivoでの検討を進めるとともに，検討した以外の液性因子の関与についても考える必要があると考えられる．
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| Strategy for Future Research Activity |
CLEC-2-ポドプラニンを軸とした骨髄微小環境において，IL-6が赤芽球造血をサポートしている可能性がある．しかし，in vivoにおいてはこの影響を示せていないことから，これ以外に赤芽球造血に影響する因子として知られる，エリスロポエチン，Stem cell factor，insulin-like growth factor 1などについても並行して検討を進めることとする．
CLEC-2刺激培地においてこれらの因子が増加しているようであれば，同様にin vivoにおける評価を行う．
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Research Products
(2 results)
