2019 Fiscal Year Research-status Report
網羅的機能解析技術を用いた白血病必須クロマチン制御機構の解明と新規治療標的の同定
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18K16089
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
仙波 雄一郎 京都大学, 医学研究科, 特別研究員(PD) (90816787)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 急性骨髄性白血病 / CRISPRスクリーニング |
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| Outline of Annual Research Achievements |
成人急性骨髄性白血病 (AML)は、ごく一部の病型を除いて未だ治療成績が不良であり、新規治療法の開発が喫緊の課題である。 昨今の白血病ゲノム解析から、 転写因子の機能異常が白血病発症に直接関与することが明らかになってきたが、その細胞分化制御の分子機構は未だ不明な点が多い。申請者は、特にクロマチンリモデリング因子による転写制御に着目し、正常幹細胞では転写因子がクロマチンリモデリング因子と共役し、細胞分化制御をおこなっていることを明らかにしてきた。本研究の目的は、AML細胞の維持に重要な転写因子およびクロマチンリモデリング因子の同定とその機能解析である。2019年度に申請者は、予後不良な高齢者AMLで遺伝子変異が高頻度に認められる転写因子TP53に注目した。独自にTp53野生型、欠失型のマウス急性骨髄性白血病 (AML) 細胞株を樹立し、2018年度に確立したCRISPRスクリーニングを駆使して転写因子TP53依存的に機能が変化する候補因子の抽出を行った。例えば、Tp53自身を標的としたsgRNAはTp53野生型AMLスクリーニングでのみenrichし、Tp53抑制因子であるMdm2, Mdm4を標的としたsgRNAはTp53野生型AMLスクリーニングでのみdropoutした。この結果から、本スクリーニングによりTp53に機能を依存した因子が抽出可能であることが確認された。さらに、Tp53変異AML特異的に細胞死を誘導する遺伝子を複数同定し、その結果を追試するため、約1000候補遺伝子を標的した二次スクリーニングを行った。その中からTp53野生型AMLでのみenrichし、Tp53欠失AMLでdropoutした遺伝子として、候補因子を同定し、現在AMLにおける機能解析を行っている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度は、昨年度確立したCRISPR-Cas9スクリーニング実験系を、独自に作成した転写因子欠失白血病細胞株に応用することで、転写因子依存的に機能変化を起こす候補因子を抽出しており、概ね順調に進展していると考えている。Tp53やMdm2など、Tp53依存的に機能が変化する遺伝子群を抽出することが可能なスクリーニングであることを確認した。特にTp53野生型では腫瘍抑制的に機能するが、Tp53欠失型では腫瘍増殖に必要な遺伝子として、候補となるクロマチン相互作用因子を同定した。候補因子については単一欠失細胞株を樹立し、表現系の再現性を確認すると同時に、機能解析を現在行っている。以上のように、実験計画に沿って実験を遂行しており、概ね順調と考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
次年度は、当該年度に行ったスクリーニングにより抽出したTP53依存的に機能が変化する因子について、分子メカニズムの探索を行う。特に、クロマチン相互作用を担う因子についてはChIP-seq, ATAC-seqを用いてクロマチン上の局在を同定する。解析に耐えうる抗体が得られない因子については、近年報告されている近接標識法を導入することで、相互作用する候補因子およびクロマチン上の局在を同定する。また、ヒトAML細胞における機能について、各種ヒトAML細胞および患者由来AML細胞を用いて解析を行う。さらに、実臨床のAML患者遺伝子変異および遺伝子発現情報を用いてTP53変異との関連について解析を行い、候補因子のAML患者における臨床的意義について評価を行う。
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