2019 Fiscal Year Research-status Report
「Treg抵抗性T細胞」を標的とした免疫学的寛解治療開発の基盤研究
| Project/Area Number |
18K16159
|
|---|
| Research Institution | Nagoya City University |
|---|
Principal Investigator |
前田 伸治 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 助教 (80381854)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
|
| Keywords | ヒト化マウス / CTLA-4 / Mass Cytometry |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
H31年度、新規Uncontrollable T細胞の候補の探索として、xenogenic-GVHDを発症するヒト化マウスによる手法を用いて解析を行った。NOGマウスにヒト末梢血のCD４陽性T細胞（1x10^7 cells）を養子移入し、x-GVHDを起こす系に、A）Treg抑制因子としてCTLA-4-Igの介入、B)コントロール を行い、Day7（xenogenic GVHDがまだ明確でない時期）に両群のSplenocyteを採取した。より詳細で多次元のT細胞表現系解析を行うため、Mass Cytometry を用いた解析を行うこととした。マウスのSplenocyteを当研究室にてFludim社のCyTOF対応抗体を用いて染色し、、次のT細胞関連因子25因子の解析を行っている.(CD3,CD4,CD8a,CD45RO,,CD45RA, CD25 (IL-2R),CD127 (IL-7Ra),CD183 (CXCR3),CD194/CCR4,CD196 (CCR6),CD161,CD195 (CCR5),CD197 (CCR7),CD185/CXCR5,HLA-DR,CD38,CD28,CD134(OX40),CD95/Fas,TIM-3,CD279 (PD-1),CD152 (CTLA-4),CD278/ICOS,CD137/4-1BB,CD223/LAG-3)。これを聖路加医学生物学研究所に依頼し、Mass Cytometry解析を行った。現在、統計ソフトウェアRを用いて、High dimensional analysisを行っている。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
動物実験施設のクリーンアップによる、動物実験の遅延と、全国的な新型コロナウィルス感染症への対応として、動物実験施設に制限がかかってているため。
|
| Strategy for Future Research Activity |
R2年度、次の研究を行い、研究を完遂する予定である。
１） hNOGマウスのA）Treg抑制因子 CTLA-4-Igの介入、B)コントロールの両群において、B群と比較しA群でKi67発現が増加している細胞表面の網羅的スクリーニング解析を行う。このために242種類の表面マーカーを解析可能なBD社のキット（BD Lyoplate, human cell surface marker screening panel）を用いる。その中でA群においてKi67が高発現のものから5-10種類くらいの表面抗原を選別、候補を同定する。
２）H31年度に行った、A群、B群のマウスSplenocyteのMass Cytometry解析結果を用いて次の解析を行なう。候補の表面マーカーの組み合わせから、既知のThサブセットにとらわれず、恣意性なく解析するために、私たちは、tSNE法による次元削減法（Journal of Machine Learning Research 9 (2008) 2579-2605, Flow Joソフトウェアと、統計ソフトRにより可能）を用いた解析を用いる（右図）。（これにより、多次元データを統計学的なクラスター解析により適切なクラスター（恣意性を排除）に分類し、それぞれにおける最適な表面マーカーの組み合わせを探索できる）。これにより、Unc-T cellsの候補の表面マーカーを同定するところまで本研究において明らかにする。
|
| Causes of Carryover |
１）当大学動物実験施設のSPFマウス室のクリーンアップと、新型コロナ感染緊急事態宣言にともなう動物実験施設の使用制限により使用マウスが制限されたことによるマウス研究の遅延のため、マウス購入に当てる研究費、その解析に用いる消耗品の研究費用を、次年度に回すため残額が生じた。制限が解除次第、ヒト化NOGマウスの研究を再開し、使用する予定である。
２）もともとフローサイトメトリーでのマウス細胞解析を行う予定であったが、より詳細に、高次元で免疫細胞を解析するため、Mass Cytometryによる解析を行うこととした。受託解析であり、その準備のためデータ解析結果を出すために遅延が生じた。H 31年度に、データを揃えるところまで終了したが、目的とするT細胞因子の候補探索までに時間がかかり、残額が生じた。現在、Mass Cytometryデータを解析中であり、CTLA-4に抵抗性のT細胞クラスターを同定できる。次年度使用額を用いて、T細胞のKi67発現の程度を調べ、網羅的な解析を行う予定である。
|
