2018 Fiscal Year Research-status Report
酵母発現系を用いたMycoplasma hominis病原因子の同定
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18K16187
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| Research Institution | Kanazawa Medical University |
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Principal Investigator |
河合 泰宏 金沢医科大学, 医学部, 准教授 (10388936)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | Mycoplasma hominis |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ヒトから分離されるマイコプラズマ科はマイコプラズマ属のMycoplasma pneumoniae による肺炎がよく知られているが、Mycoplasma hominis、Mycoplasma genitalium 、ならびにウレアプラズマ属なども尿道炎、骨盤内感染症、早産を引き起こす原因になると考えられている。また、M. hominisは、骨盤内炎症性疾患（pelvic inflammatory disease：PID）や帝王切開術後感染症などの周産期病態との関連や従来効果のある抗菌薬に対する耐性が報告されている。
マイコプラズマ属は細菌蛋白を宿主へ注入し、宿主細胞内での生理的機能を撹乱することにより病原性を発揮していると予想される。マイコプラズマ属の病原因子の同定により、新たなマイコプラズマ属感染の治療・予防および持続感染による慢性炎症の予防・進行阻止が期待できる。
M. hominisの全ゲノム情報を基に、既に機能が明らかにされている遺伝子（代謝系に機能することが知られているなど）を排除した機能未知遺伝子を選抜し、それぞれに対する1対のプライマーを作製した。
M. hominisのATCC23114株を液体培地で培養し、培養液からゲノムの抽出を行った。
M. hominisゲノムから、忠実性が高くかつ増幅効率が高いKOD plusポリメラーゼを用いて遺伝子を増幅し、PCR産物を得ることができた。
得られたPCR産物を、酵母用ドナーベクターにGateway systemを用いて１ステップでクローニングを行った。クローニング後、それぞれのクローンの塩基配列の確認を行い、-80℃に保存し、スクリーニングに備えている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
遺伝子組み換え実験の申請や酵母発現系実験の準備に時間を要した。
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| Strategy for Future Research Activity |
M. hominisの機能未知遺伝子ライブラリーを酵母株に形質転換し、網羅的にM. hominis病原因子候補をスクリーニングする。誘導培地での過剰発現によりi) 致死になるもの、ii) 液胞蛋白質マーカーを分泌するものを病原因子候補とする。
Green Fluorescent Protein (GFP)で標識した病原因子候補をHeLa細胞に導入し、病原分子の細胞内局在を種々のオルガネラマーカーと比較し共焦点レーザー顕微鏡を用いて解析する。
また、病原分子を導入した際の経時的な細胞の変化を、タイムラプス蛍光顕微鏡を用いて細胞生物学的および生化学的に解析する。
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| Causes of Carryover |
当該年度に購入予定であった酵母発現系実験のための高精度型インキュベーターとマイクロチューブミキサーを次年度購入予定とした。
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