2021 Fiscal Year Research-status Report

酵母発現系を用いたMycoplasma hominis病原因子の同定

Research Project

Project/Area Number	18K16187
Research Institution	Kanazawa Medical University
Principal Investigator	河合泰宏金沢医科大学, 金沢医科大学氷見市民病院, 准教授 (10388936)
Project Period (FY)	2018-04-01 – 2023-03-31
Keywords	Mycoplasma hominis / 病原因子
Outline of Annual Research Achievements	Mycoplasma hominisは、骨盤内炎症性疾患（pelvic inflammatory disease：PID）や帝王切開術後感染症などの周産期病態との関連や従来効果のある抗菌薬に対する耐性が報告されている。マイコプラズマ属は細菌蛋白を宿主へ注入し、宿主細胞内での生理的機能を撹乱することにより病原性を発揮していると予想される。M. hominisの病原因子の同定により、新たなマイコプラズマ属感染の治療・予防および持続感染による慢性炎症の予防・進行阻止が期待できる。 M. hominisの全ゲノム情報を基に、機能未知遺伝子を選抜し、それぞれに対する1対のプライマーを作製した。M. hominisのATCC23114株を液体培地で培養し、培養液からゲノムの抽出を行った。抽出したゲノムから得られたPCR産物を、酵母用ドナーベクターにクローニングを行い、クローニング後、それぞれのクローンの塩基配列の確認を行い、-80℃に保存し、スクリーニングに備えている。作製したライブラリーを酵母株に形質転換し、網羅的にM. hominis病原因子候補をスクリーニングするために、酵母発育用の培地や酵母遺伝子発現を調整する誘導培地の作成、酵母培養用の酵母発現系の実験環境の整備が完了できたが、実際に使用する酵母の育種が安定せず、インキュベーターの調整や菌株の評価を行っている。 ATCC株だけでなく、臨床分離株についても、培養、ゲノム抽出を行い、既に機能が明らかにされている一部の遺伝子配列について解析を行い、菌株間での相違について検討を行った。また、M. hominisは他のMycoplasmaと異なり、第一選択薬となるマクロライド系抗菌薬に耐性を示す。他の抗菌薬などが使用されることがあるが、MIC測定を行ったところ、一部で異なる株を認めたが既報の変異は確認できなかった。さらに培養の過程において非常に増殖力の強い菌株が見いだされた。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 4: Progress in research has been delayed. Reason 酵母発現系実験を確実に実施し、安定した結果が得られる実験環境の整備に時間を要した。また、臨床分離株でも検討するために、増殖力、薬剤感受性など評価を行い、特徴ある菌株を見いだすことが出来たが、既報の遺伝子変異は認められず、全ゲノム解析の必要性がでてきたため。
Strategy for Future Research Activity	標準株（ATCC23114）を用いたM. hominisの機能未知遺伝子ライブラリーを酵母株に形質転換し、網羅的にM. hominis病原因子候補をスクリーニングする。誘導培地での過剰発現により致死になるものを病原因子候補とする。Green Fluorescent Protein (GFP)で標識した病原因子候補をHeLa細胞に導入し、病原分子の細胞内局在を種々のオルガネラマーカーと比較し共焦点レーザー顕微鏡を用いて解析する。また、病原分子を導入した際の経時的な細胞の変化を、タイムラプス蛍光顕微鏡を用いて細胞生物学的および生化学的に解析する。また、特徴のある臨床分離株を数株選択し、全ゲノム解析の上、これら遺伝子情報を用いた病原因子候補のスクリーニングも行う。
Causes of Carryover	酵母培養のために使用する高精度型インキュベーターの二酸化炭素濃度が安定せず、修理で対応できない場合には、次年度購入する予定とした。また、特徴的な薬剤感受性や増殖性を示した臨床分離株について、既報の遺伝子変異は認められず、全ゲノム解析を次年度に行う予定となった。病原因子スクリーニングを、標準株に加えて臨床分離株のゲノム情報も参考にして行うため、多検体処理に用いるマイクロチューブミキサーを次年度購入予定とした。