2022 Fiscal Year Research-status Report
酵母発現系を用いたMycoplasma hominis病原因子の同定
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18K16187
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| Research Institution | Kanazawa Medical University |
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Principal Investigator |
河合 泰宏 金沢医科大学, 金沢医科大学氷見市民病院, 准教授 (10388936)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | Mycoplasma hominis / 病原因子 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
Mycoplasma hominisは、骨盤内炎症性疾患や帝王切開術後感染症などの周産期病態との関連や従来効果のある抗菌薬に対する耐性が報告されている。
マイコプラズマ属菌は細菌蛋白を宿主へ注入し、宿主細胞内での生理的機能を撹乱することにより病原性を発揮していると予想される。M. hominisの病原因子の同定により、マイコプラズマ属感染症の新たな治療や予防および持続感染による慢性炎症の阻止が期待できる。
M. hominisの全ゲノム情報を基に、機能未知遺伝子を選抜し、それぞれに対する1対のプライマーを作製した。M. hominisのATCC23114株を液体培地で培養し、培養液からゲノムの抽出を行った。抽出したゲノムから得られたPCR産物を、酵母用ドナーベクターにクローニングを行い、クローニング後、それぞれのクローンの塩基配列の確認を行い、-80℃に保存し、スクリーニングに備えている。
作製したライブラリーを酵母株に形質転換し、網羅的にM. hominis病原因子候補をスクリーニングするために、酵母発育用の培地や酵母遺伝子発現を調整する誘導培地の作成、酵母培養用の酵母発現系の実験環境の整備が完了した。しかし、実際に使用する酵母の増殖が不安定であり、増殖抑制の評価に課題を認めていたが、インキュベータの調整や菌株を変更することで本研究に使用する目途をつけることができた。
ATCC株だけでなく、臨床分離株についても、培養、ゲノム抽出を行い、既に機能が明らかにされている一部の遺伝子配列について解析を行い、菌株間での相違について引き続き検討を行った。M. hominisは他のMycoplasmaと異なり、第一選択薬となるマクロライド系抗菌薬に耐性を示す。各種抗菌薬のMIC測定を行い、一部で既報の変異なく標準株と異なる値を示す株を認めたが、その場合でも効果が期待できる抗菌薬を見出すことができた。非常に増殖力の強い菌株も含め、全ゲノム解析を準備中である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
酵母発現系実験を確実に実施し、安定した結果が得られる実験環境の整備に時間を要した。また、臨床分離株でも検討するために、増殖力の比較や薬剤感受性試験などを行い、特徴ある菌株に対しても効果が期待出来る抗菌薬の選抜と評価に時間と労力が必要であった。特徴ある菌株の全ゲノム解析を行う準備に時間を要している。
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| Strategy for Future Research Activity |
標準株（ATCC23114）を用いたM. hominisの機能未知遺伝子ライブラリーを酵母株に形質転換し、網羅的にM. hominis病原因子候補をスクリーニングする。
誘導培地での過剰発現により致死になるものを病原因子候補とする。
Green Fluorescent Protein (GFP)で標識した病原因子候補をHeLa細胞に導入し、病原分子の細胞内局在を種々のオルガネラマーカーと比較し共焦点レーザー顕微鏡を用いて解析する。また、病原分子を導入した際の経時的な細胞の変化を、タイムラプス蛍光顕微鏡を用いて細胞生物学的および生化学的に解析する。また、特徴のある臨床分離株を数株選択し、全ゲノム解析の上、これら遺伝子情報を用いて病原因子候補のゲノムを比較する。
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| Causes of Carryover |
酵母培養のため高精度型インキュベーターを購入予定であったが、研究実施施設の設備を使用できたため購入しなかった。
令和5年4月より所属期間を変更し、酵母培養に使用する高精度型インキュベーターを次年度購入する予定とした。
また、特徴的な薬剤感受性や増殖性を示した臨床分離株について、全ゲノム解析を引き続き行う予定である。
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Research Products
(1 results)
