2019 Fiscal Year Research-status Report
Generation of SIN3A mutant knock-in mice using GONAD method and searching of target molecule of breast cancer
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18K16255
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| Research Institution | Yamaguchi University |
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Principal Investigator |
渡邉 健司 山口大学, 大学研究推進機構, 助教 (50711264)
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2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 乳がん / SIN3A / GONAD法 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ERα 陽性乳がんの治療の一つとして内分泌療法が行われるが、多くの場合耐性が認められる。耐性を打破するためには、恒常的な ERα 高発現を抑制する効果的な治療法の開発が必要である。一方、乳がんはゲノム異常の蓄積が病態に関与する。研究代表者らは、ERα 発現を増加させる遺伝子変異の同定を試みた。研究代表者らは、ERα 発現を増加させる遺伝子変異を同定するため、これまでにERα 高発現群、低発現乳がん患者組織のゲノムDNAについて、次世代シークエンサーを用いた全エクソーム解析を行った。検出した変異遺伝子の内、ERα の上流に位置し、ERα の発現を抑制する機能が報告されていた Switch-Independent 3 Transcription Regulator Family Member A (SIN3A) の変異に着目し、ERα 発現に対する機能を検討した結果、(i) 変異体は ERα の発現を上昇させるLoss-of-function 変異であること、(ii) 変異体は、乳がん細胞株の増殖を促進することを見出すことができた (Watanabe et al., Sci. Rep., 2018) 。現在、SIN3A変異体の機能をさらに詳細に検討するために、Genome-editing via Oviductal Nucleic Acids Delivery (GONAD)法を用いてSIN3A変異体を乳腺特異的に発現するノックインマウスの作成を試みている。この方法は、これまで熟練の技術が必要であった採卵、核酸の顕微注入、移植操作をなくすことで、小規模研究室でも遺伝子改変マウスを作製することを可能にする画期的な手法である。この方法を用いてSIN3A 変異体ノックインマウスを作成し、機能を詳細に検討していく。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
本研究では、SIN3A変異乳がんの分子機構を解明し、治療標的を同定するために、以下の３点について明らかにすることを考えている。①GONAD法により、乳腺特異的変異SIN3A発現マウスを作成する。②作成したマウスまたは、SIN3A変異導入ヒト乳がん細胞株を用いてSIN3A機能低下乳がんにおける標的遺伝子の同定を行う。③作成したマウスにおいて腫瘍の発生を確認できた場合、同定した標的分子に対する治療薬の効果を検討する。上記の内容を実行するために、以下の方法を計画していた。現在①、②を進行中である。当初の計画では、長鎖の２本鎖 DNA を細胞の gDNA またはマウスの gDNA にGONAD 法を用いて導入する計画であったが、長鎖 DNA の導入効率が予想よりも低くノックイン細胞の作出が困難であった。研究協力者の検討により、遺伝子変異を導入する際に１本鎖オリゴDNAを用いた場合、作成効率が上昇する結果が得られたため、現在１本鎖オリゴDNAを用いたGONAD 法により遺伝子変異の導入を試みている。
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| Strategy for Future Research Activity |
研究代表者らは、ERα 発現を増加させるSIN3A遺伝子変異乳がんの分子機構を解明するために、SIN3A変異体を発現するノックインマウスの作成を試みている。これまでの検討により、長鎖の2本鎖DNAのノックインは導入効率が低いことがわかった。また、1本鎖DNAを用いるとノックインマウスの作成が可能になることがわかった。そこで、今後は、1本鎖DNAを用いてノックインを試みる。1本鎖のオリゴDNAの合成は、2000塩基までが限界である。CAG promotor-LSL (LoxP-DsRed-stop-LoxP)配列、GFP-SIN3A mutant cDNA 配列前半、後半の3つに分け、ノックインを試みる。また、研究協力者の検討で短鎖の1本鎖オリゴDNAを用いたノックインマウスの作成に成功したことから、SIN3A遺伝子のゲノム配列に変異を導入したノックインマウスを作成する。乳腺特異的な発現ではないが、SIN3Aに変異があることで、乳がんが発生するマウスの作成に成功すれば乳がん発症のメカニズム解明に寄与することができる。
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| Causes of Carryover |
長鎖のプラスミドDNAを用いたノックイン細胞の作成が困難であったことから、新たな使用計画を考えた。新たに1本鎖オリゴDNA を用いたSIN3A 変異体ノックイン細胞、マウスを作成するため、以下のような予算の使用を予定している。CRISPER/CAS9発現プラスミドの準備費用として、2 万円を想定している。gRNA、変異配列ノックインのための1本鎖オリゴDNAの設計・合成費用として15 万円を想定している。 エレクトロポレーション用試薬の購入費として、20 万円を想定している。培地等の細胞培養用試薬として10万円を想定している。ノックイン配列のシークエンスによる確認費用として3万円を想定している。ノックイン細胞の細胞増殖機能確認のためのxCELLigence 用試薬 xCELLigence のランニング費用 (E-プレート)として、10 万円を想定している。ICRマウス、Cre-Tg マウスの購入・維持費として10万円を想定している。細胞の培養に必要な血清、培地やディッシュ、プレート等に年間5万円を見込んでいる。成果について論文投稿費及び日本分子生物学会、日本生化学会での学会発表のための旅費として15万円を想定している。
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Research Products
(1 results)
