Immunotolerance of islet transplantation using bioengineering cell sheet by induced loss of antigenicity

2020 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 18K16282
• Research Institution: University of the Ryukyus
• Principal Investigator: 大野 慎一郎 琉球大学, 病院, 助教 (90567174)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: 膵島細胞移植 / immunotolerance / MHC class Ⅰ / 細胞シート / loss of antigenicity

Outline of Annual Research Achievements

本研究では CRISPR/Cas9システムによりMHC class Iを構成する分子であるβ2ミクログロブリン遺伝子を欠失するように膵島細胞に対して遺伝子編集を行い、MHC class Iの発現を抑制し宿主のT細胞から認識出来なくし拒絶反応を軽減することを目的としている。非血液系細胞では実験手法が確立出来ていない。ヒト膵島細胞は資源が限られるため、まずは汎用的な非血液系細胞株である肝癌細胞株HepG2を用いて実験系の確立を行った。HepG2を培養しレンチウイルスベクターを用いて遺伝子導入を行った。FACSでMHC class Iの表出を確認、25-29%の細胞で陰性化を認めた。純粋なMHC class I陰性分画を得る目的で磁気ビーズ分離法を行い、 MHC class I陰性細胞を96%の純度で得られた。以上より、非血液系細胞でも遺伝子導入によるMHC class Iの抑制および高純度のMHC class I抑制細胞の細胞を分離出来た。次にアルバータ大学からヒト膵島細胞を輸入、トリプシン処理にて単細胞化後、上記方法で遺伝子導入を試みた。FACSで遺伝子導入前後のMHC class Iの発現割合の変化を確認するも、MHC class I陰性分画が多く、明確な変化を認めなかった。外分泌腺及び死細胞の混入が多いことが原因と考えられたため、β細胞のみを分離。同細胞のMHC class1を測定するとやはり発現率が10%に満たないという結果であった。MHC class１を発現しているβ細胞に導入するも膵島のviabilityが低いためか、導入効率が悪く発現抑制を確認できなかった。今後はiPS細胞由来のβ細胞株を用い、同様の実験を行い、最終的には遺伝子導入細胞をビーズ分離法にてセレクションを行う予定であったが、研究者在籍地が変更となり、実験設備を整える間に研究期間が終了となってしまった。