横隔膜ヘルニア症における横隔膜欠損の発症機序の解明と新規予防法を目指した基礎研究

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K16288
• Research Institution: Juntendo University
• Principal Investigator: 高橋 俊明 順天堂大学, 医学部, 非常勤助教 (70624857)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: 先天性横隔膜ヘルニア / 肺低形成 / Pbx1 / Meis1 / Runx1 / ナイトロフェン / 横隔膜

Outline of Annual Research Achievements

本研究は、横隔膜欠損の分子メカニズムを解明するため、先天性横隔膜ヘルニア関連遺伝子の１つとされるPre-B-cell leukemia transcription factor 1という蛋白をコードするPbx1に着目した。先天性横隔膜ヘルニアの動物モデルを作製し、Pbx1や関連する遺伝子の発現、およびタンパク産生をqRT-PCR法や、組織免疫染色法で分析する。横隔膜欠損における鍵分子を同定し、発生機序を解明することにより、疾患に対する新たな予防法の開発への応用を目指すものである。
2018年度には、先天性横隔膜ヘルニアの動物モデルの作成に成功し、横隔膜検体のcDNAの作成が完了した。2019年度には、Pbx1、またはそれと一連のシグナル経路で働くと言われている、Myeloid ecotropic integration site 1 (Meis1)やRunt-related transcription factor 1 (Runx1)などの特異的なPrimerを使用し（βactinでNormalization）、qRT-PCRを施行して、遺伝子発現を評価した。また横隔膜のパラフィン切片（D13、D15、D18）をそれぞれ候補蛋白Pbx1、Meis2、Runx1に対する抗体で蛍光免疫染色し、Confocal Microscopeを使用し複数の実験者で発現を評価した。
そしてその結果、コントロールと比較し、疾患モデル群の横隔膜や肺組織において、Pbx1とMeis1、Runx1のmRNAの発現は有意に減少していることが証明された。また蛍光免疫染色においても、疾患モデル群の横隔膜や肺組織において、Pbx1とMeis1、Runx1の蛋白の発現がコントロールに比べ有意に減少していることが証明された。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

2018年度作成した検体が、精度が良かった。またPCRや蛍光免疫染色といった実験手技が問題なく進行した。
以上より、当初の計画通りに順調に伸展していると考える。

Strategy for Future Research Activity

2019年度の結果を集積し、再評価する。他の文献も参考にし、Pbx1は、Meis2、Runx1という蛋白と結合して、ともに一連のシグナル経路の中で働く可能性があるのか考察する。さらにそのシグナルの障害が、胎生早期での横隔膜の発達において重要なPPFの発生を阻害し、結果として横隔膜欠損が生じているという理論が正しいのか再考察する。
機会があれば、この段階でこれまでの結果を国際的な学会で発表し、その分野の専門家にも意見を聞く。
また、横隔膜の発生異常を引き起こす標的蛋白（候補はPbx1）を、ナイトロフェン投与した母獣に腹腔内投与し、胎仔への影響を確認する。Pbx1導入＋ナイトロフェン誘導ラットモデルの横隔膜を前述の方法で、採取・解析する。他の動物モデル（ノックアウト等）での報告と比較、およびヒトでの遺伝子研究分野での報告とともに比較・統合することにより、ヒトでみられる先天性横隔膜ヘルニアの胎児期における予防治療を模索する。

Causes of Carryover

該当薬品の購入や、関係学会の参加費用などに使用していくつもりである。