2019 Fiscal Year Research-status Report

The detection of early stage pancreatic cancer with sandwich ELISA using tumor specific lectins

Research Project

Project/Area Number	18K16298
Research Institution	University of Tsukuba
Principal Investigator	下村治筑波大学, 医学医療系, 講師 (60808070)
Project Period (FY)	2018-04-01 – 2021-03-31
Keywords	膵癌マーカー / 糖タンパク / レクチン / 糖鎖
Outline of Annual Research Achievements	本研究では膵臓癌の患者血清を用いて、膵癌細胞由来の糖タンパクを同定し、それらの糖鎖解析を行い、認識する複数のレクチンの同定、2種類以上のレクチンによる特異性の高い膵癌診断システムを構築することが目的である。まず我々がこれまで同定した膵癌細胞株を用いて培養上清を持ちいて、我々が発見同定した臨床膵癌細胞に反応するrBC2LCNレクチンを用いて、サンドイッチアッセイ系で同定、検出することに成功した。また、ヒト膵癌腫瘍片を免疫抑制マウスに移植したPDXマウスから採取した血清でも、同様に膵癌由来の糖鎖を同定することに成功した。また、倫理委員会の承認を得て回収した実際の患者血清を用いて、本レクチンによるサンドイッチアッセイ系で検出を試みたところ、約半数の患者で検出を確認できたが、特異性の面で改善が必要であった。膵癌細胞から血清中に分泌された糖タンパクを正確に検出するには、糖鎖と同時にコアタンパクを認識する必要があると判断した。そこで、PDX腫瘍中に含まれるタンパクをrBC2LCNレクチンによる免疫沈降法で分離し質量分析LCMS法で解析を行ったところ、40の候補コアタンパクが上がった。これらの中から、糖タンパクをレクチン沈降、WB法（LP/WB法）にてバンドが確認された8つを候補タンパクと判断した。これらの中から健常人血清より患者血清で有意に反応性が高かった糖タンパクAを最終的な候補タンパクと同定した。現在、糖タンパクAを認識する抗体とrBC2LCNレクチンによるサンドイッチアッセイ系を確立し、複数検体での解析を開始している。糖タンパクAの同定とレクチンと抗体によるサンドイッチELISA法により特異性高く膵癌を検出できる可能性があり、新たな膵癌マーカーとして特許出願した。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 本研究では膵癌由来の糖タンパクをレクチンを用いた手法により、患者血清中から同定し膵癌の新たなマーカーを同定することが目的である。これまでに我々が同定した臨床膵癌に特異的に反応性を有するrBC2LCNレクチンを中心に、複数レクチンを同定して糖鎖のみで膵癌マーカーの同定を試みた。しかしレクチンのみを用いた手法では、患者血清から糖鎖を認識することは可能であったが、健常者と識別することは困難であり特異性の面で課題が残った。膵癌細胞由来の糖タンパクを効率的に検出、同定して膵癌マーカーとして用いるにはコアタンパクも同時に検出するシステムが必要であると判断した。我々はこれまで開発してきたレクチン工学の手法を用いて、rBC2LCNが認識するH type1/3/4糖鎖構造をもつ糖タンパクを、PDXモデルの腫瘍タンパクから分離同定することを試みた。その結果、健常人血清では検出されず、膵癌患者血清のみから検出される糖タンパクAの同定に成功した。候補糖鎖の組み合わせで診断を試みたが、より特異性が上げられるように、膵癌細胞由来の糖鎖とタンパク質を同時に認識、検出するシステムを構築する方法に変換した。現在、複数の患者から糖タンパクAが同定できるか多数の検体を用いた解析に向けて、検体採取の調整を行っている。
Strategy for Future Research Activity	これまでに膵癌細胞由来の糖タンパクAを、マウスモデル、患者血清を用いた解析により同定した。今後の予定として、これらの糖タンパクAが実際の臨床膵癌検体で検出されるか、rBC2LCNを用いたレクチン染色に加えて、タンパクAの抗体を用いた蛍光共染色を行い、染色部位がOverlapされるか、多数の膵癌検体を用いて糖タンパクAの陽性率を把握する。さらに腫瘍の増大に応じ分泌量の変化に関して、臨床腫瘍片マウスモデルを用いて経時的に血清採取し、腫瘍の増大有無と血清での検出量に関して詳細に検証する予定である。また、単一施設での検体採取では大規模な検証には限界があり、他施設研究での患者血清採取が必要である。まず検出感度、特異性に関して詳細な検証を行い有用性を確認する。また企業連携し、容易に検出できるように商品化に向けた開発も進めていく。大規模試験に関しては患者血清は関連施設からの血清採取または臨床試験登録より全国的な研究に向かう。
Causes of Carryover	本研究で得た成果に関して、2020年4月に開催される米国癌学会AACRで発表予定（発表決定）となったため、旅費と学会参加費を次年度予算として計上した。また、臨床膵癌検体のレクチンと抗体による蛍光2重染色を行うための、スライドグラス作成、試薬用の予算として計上した。