2018 Fiscal Year Research-status Report

肺移植の拒絶反応における免疫チェックポイント分子の関与及び免疫寛容の誘導

Research Project

Project/Area Number	18K16411
Research Institution	Chiba University
Principal Investigator	海寳大輔千葉大学, 医学部附属病院, 医員 (30802558)
Project Period (FY)	2018-04-01 – 2020-03-31
Keywords	肺移植 / 慢性拒絶 / 免疫寛容 / 免疫チェックポイント
Outline of Annual Research Achievements	免疫寛容モデル作成の前段階として、PD-L1遺伝子導入樹状細胞の作成のために、PD-L1遺伝子をクローニングし、PD-L1遺伝子を導入したレトロウイルスベクター（pMX-GFP）の作製を行った。マウス胸腺のリンパ球に対して、実際に作製したPD-L1遺伝子導入レトロウイルスベクターと何も遺伝子導入されていないレトロウイルスベクターをそれぞれ感染させることにより、前者でPD-L1がリンパ球で強発現していることを確認した。現在ドナーマウスC57BL/10の骨髄より採取した骨髄細胞と組み換えレトロウイルスベクターを培養し、樹状細胞に分化させ、PD-L1遺伝子導入することを進めている状況である。マウス同所性肺移植モデルについては、肺移植手技は安定し、慢性拒絶反応（CLAD）モデルの作成を進めている。C57BL/6からC57BL/6へと左肺を移植するisograftを作成しコントロールとして、CLADモデルとしてドナーC57BL/10(MHC H2b)からマイナー抗原不一致のレシピエントC57BL/6(MHC H2b)に移植するモデルを用いている。先行研究に従いCLADが約50％で発症する移植21日後に犠牲死とし、血液・気管支肺胞洗浄液(BAL)・胸腔内/腹腔内リンパ節・左右肺・脾臓を採取し、肺の病理組織検査（H-E染色）、免疫染色(trichrome染色、PD-L1染色)を行っている。肺、リンパ節より抽出したmRNAに対する、PD-1発現解析や、各臓器やserumでのサイトカイン及びサイトカイン産生細胞の解析については、今後進めていく予定である。マウス抗PD-L1抗体投与による拒絶反応の変化については、CLADモデルで移植後day 3.7.14にマウス用抗PD-L1抗体を腹腔内投与し、拒絶反応への影響について通常のCLADモデルと比較検討していく予定である。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 免疫寛容モデル作成の前段階として、PD-L1遺伝子導入樹状細胞の作成のために、PD-L1遺伝子をクローニングし、PD-L1遺伝子を導入したレトロウイルスベクター（pMX-GFP）の作製を行った。マウス胸腺のリンパ球に対して、実際に作製したPD-L1遺伝子導入レトロウイルスベクターと何も遺伝子導入されていないレトロウイルスベクターをそれぞれ感染させることにより、前者でPD-L1がリンパ球で強発現していることを確認した。現在ドナーマウスC57BL/10の骨髄より採取した骨髄細胞と組み換えレトロウイルスベクターを培養し、樹状細胞に分化させ、PD-L1遺伝子導入することを進めている状況である。マウス同所性肺移植モデルについては、肺移植手技は安定し、慢性拒絶反応（CLAD）モデルの作成を進めている。C57BL/6からC57BL/6へと左肺を移植するisograftを作成しコントロールとして、CLADモデルとしてドナーC57BL/10(MHC H2b)からマイナー抗原不一致のレシピエントC57BL/6(MHC H2b)に移植するモデルを用いている。先行研究に従いCLADが約50％で発症する移植21日後に犠牲死とし、血液・気管支肺胞洗浄液(BAL)・胸腔内/腹腔内リンパ節・左右肺・脾臓を採取し、肺の病理組織検査（H-E染色）、免疫染色(trichrome染色、PD-L1染色)を行っている。肺、リンパ節より抽出したmRNAに対する、PD-1発現解析や、各臓器やserumでのサイトカイン及びサイトカイン産生細胞の解析については、今後進めていく予定である。マウス抗PD-L1抗体投与による拒絶反応の変化については、CLADモデルで移植後day 3.7.14にマウス用抗PD-L1抗体を腹腔内投与し、拒絶反応への影響について通常のCLADモデルと比較検討していく予定である。
Strategy for Future Research Activity	千葉大学呼吸器病態外科学のみではなく、免疫細胞医学教室（本橋新一郎教授）、免疫発生医学教室（中山俊憲教授、木内政宏助教）と連携して、引き続き共同研究を行っていく。移植免疫学及び腫瘍免疫学の専門家が集まり定期的にカンファレンスを実施し進捗状況確認と研究計画修正を行っていく。
Causes of Carryover	平成30年度は、マウスの肺移植技術の習得、およびウイルスベクターの作成、樹状細胞への導入まで終了したが、具体的な肺移植慢性拒絶の解析まで至らなかったため、未使用額が生じた。次年度は、その研究成果の解析、発表を行うため、未使用額はその経費にあてる予定である。