難治性肺疾患に対する脂肪組織由来間葉系幹細胞を用いた幹細胞治療の基礎研究

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K16424
• Research Institution: Nagasaki University
• Principal Investigator: 土肥 良一郎 長崎大学, 病院(医学系), 助教 (00817786)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: 肺再生 / 脂肪組織由来間葉系幹細胞 / 共培養 / 血管内皮細胞

Outline of Annual Research Achievements

難治性肺疾患を対象とした幹細胞治療による肺再生医療の実用化へ向けて解決すべき課題は、損傷を受けた肺組織への幹細胞の定着率の改善、および生体内外における幹細胞の各種肺細胞への分化誘導法の確立である。本研究の目的は、将来的に脂肪組織由来間葉系幹細胞（Adipose-derived mesenchymal stem cells, 以下AT-MSC）を用いた肺再生治療を実現するために、確立した下記の実験系を用いてAT-MSCの肺組織への定着率改善、および肺胞上皮細胞への分化誘導法を確立することにある。
我々は、脱細胞化し肺の細胞外骨格を残したままの肺スカフォールドを用いて、In vitroで生体内に近い環境で幹細胞を三次元培養するシステムを確立していた。平成30年度は、障害肺ラットモデルへの幹細胞投与の前段階実験として、正常ラット肺の脱細胞化スカフォールド上に経気管支的にまたは経肺血管的にAT-MSCを投与し、細胞外器質への幹細胞の定着と遊走能の解析、および伸展刺激下に細胞外器質上での肺胞上皮細胞への分化を試みた。
AT-MSC単独の投与では定着率が悪く、血管内皮細胞との共培養により定着率が改善し、AT-MSCの肺組織への定着の周辺環境として血管内皮細胞との相互作用が重要である可能性が示唆された。また、AT-MSCの肺胞隔壁などの細胞間質への自己遊走を認め、換気による肺胞伸展刺激により肺胞腔を置換するようにAT-MSCが生着することを明らかにした。しかし、細胞間質や血管壁に分布したAT-MSCが血管平滑筋細胞などへの分化を示す一方で、肺胞腔に分布したAT-MSCにおける肺胞上皮細胞マーカーの発現が認められず、上記条件下では、諸家の報告にあるような1型肺胞上皮細胞および2型肺胞上皮細胞への分化を認めなかった。
AT-MSCの肺組織への定着率の改善について、経肺血管的に血管内皮細胞との同時投与することで改善する可能性が示唆された。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

平成30年度は主として、AT-MSCの肺組織への定着率改善の実験を行った。一方で、脱細胞化フカフォールド上におけるAT-MSCの2型肺胞上皮細胞への分化については現時点では再現できておらず、実験計画の進捗遅れを来している。

Strategy for Future Research Activity

脂肪織由来間葉系幹細胞の肺胞上皮細胞への分化を再現できていない点への対策としては、引き続き上記の実験系を用いて、肺胞上皮細胞への分化誘導培地の添加、共培養する細胞の変更による肺胞上皮細胞への分化誘導を行っている段階である。さらには肺胞上皮細胞への効率的な分化誘導を目的に、脂肪組織由来間質細胞の多く含まれるとされるMuse細胞（Multilineage differentiating stress enduring cell）を抽出して投与することを検討している。AT-MSCもしくはMuse細胞による肺胞上皮細胞への分化を再現できたのちは、幹細胞の定着率の改善を可能とするニッチ環境の探索や、組織再構築を可能とする分化再生誘導因子の解明を進め、最終的には障害肺モデルにおける幹細胞投与を行って損傷修復や肺再生の効果について検証していく。
一方で、AT-MSCやMuse細胞の肺胞上皮細胞への分化誘導を確認できなかった場合を想定し、同時並行で、すでに2型肺胞上皮細胞への分化誘導法が確立されているiPS細胞を用いて、生体内の肺組織環境を模倣した実験系において、実験の目的である幹細胞定着率の改善に寄与するニッチ環境の探索、定着後の組織再構築を促進する再生誘導因子の同定を進めていき、幹細胞治療による肺再生治療の基礎実験として課題を上記課題の解決を進める予定である。さらには、iPS細胞のクララ細胞などの気道上皮細胞への分化誘導因子の解明へとつなげていきたい。

Causes of Carryover

間葉系幹細胞の肺胞上皮細胞への分化の再現に難渋しているため、その対策としてMuse細胞やiPS細胞の導入の検討が必要となり、その技術導入や実験施設における実験許可などのために、実験の進捗が遅れているため。
令和元年度においては、第一の実験目的である脂肪組織由来間葉系幹細胞を肺胞上皮細胞へ分化誘導するために分化誘導因子を追加して実験を進めて行くために、各種分化誘導因子、培地などの試薬を用いる予定である。同時並行で、脂肪組織からソーティングしたMuse細胞あるいは多能性幹細胞（iPS細胞）を用いて、肺胞上皮細胞への分化誘導を試みるため、ソーティングのための抗体などの試薬、iPS細胞、専用培地、分化誘導因子を購入予定である。同様に、第2の目的で幹細胞もしくは分化誘導された肺胞上皮細胞の肺内への定着率改善の因子検索を、健常および病気モデル肺の脱細胞化肺、および病気モデル肺において、細胞イメージングや生体イメージングなどの細胞画像解析によってはじめ、最終的にはタンパク、遺伝子発現の解析へつなげて行きために、イメージング用の抗体、遺伝子発現解析のためのキットなどの試薬を購入する予定である。残額をこれらの物品費や旅費へ使用する予定である。