2019 Fiscal Year Research-status Report

難治性肺疾患に対する脂肪組織由来間葉系幹細胞を用いた幹細胞治療の基礎研究

Research Project

Project/Area Number	18K16424
Research Institution	Nagasaki University
Principal Investigator	土肥良一郎長崎大学, 病院(医学系), 助教 (00817786)
Project Period (FY)	2018-04-01 – 2021-03-31
Keywords	脂肪組織由来間葉系幹細胞 / 肺胞上皮細胞 / 肺再生 / 細胞治療 / Muse細胞
Outline of Annual Research Achievements	難治性肺疾患を対象とした幹細胞治療による肺再生医療の実用化へ向けて解決すべき課題は、損傷を受けた肺組織への幹細胞の定着率の改善、および生体内外における幹細胞の各種肺細胞への分化誘導法の確立である。我々は脱細胞化肺スカフォールドを用いて生体内に近い環境で幹細胞を三次元培養するシステムを確立してきた。本研究の目的は、将来的に脂肪組織由来間葉系幹細胞（Adipose-derived mesenchymal stem cells, 以下AT-MSC）を用いた肺再生治療を実現するために、上記実験系を用いてAT-MSCの肺組織への定着率改善、および肺胞上皮細胞への分化誘導法を確立することにある。平成30年度は、正常ラット肺の脱細胞化スカフォールド上において、① AT-MSC単独の投与では定着率が悪く、血管内皮細胞との共培養により定着率を改善すること、② AT-MSCの肺胞隔壁などの細胞間質への自己遊走と同時に、肺胞伸展刺激によりAT-MSCが肺胞腔に定着することを明らかにした。しかし、上記条件下では定着率の改善を得るも、AT-MSCが血管平滑筋細胞や周皮細胞への分化傾向を示すため、目的である肺胞上皮への分化誘導ができなかった。令和元年度は、同脱細胞化スカフォールド上において、ラットより抽出した肺胞上皮細胞との共培養によるAT-MSC定着率の改善を認め、肺組織への定着の周辺環境として肺胞上皮細胞との相互作用が重要である可能性が示唆された。またAT-MSC内に多含するとされる、よりStemnessの強いMuse細胞（Multilineage differentiating stress enduring cell）を抽出して分化誘導するモデルも作成した。Muse細胞単独投与による脱細胞化スカフォールド上への定着を確認し、Muse細胞を用いた肺組織修復の細胞治療の可能性が示唆された。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 脱細胞化スカフォールド上において、各種細胞との共培養によるAT-MSCの肺組織への定着率改善効果を明らかにしてきた。また、Muse細胞の脱細胞化スカフォールドへの定着を明らかにした。一方で、主たる目的であるAT-MSCの肺胞上皮細胞への分化誘導を実現できていないため、実験進捗が遅れている。また、Muse細胞の肺胞上皮細胞への分化誘導では、培養細胞の5％以下のPopulationでありソーティングでは細胞収量が少なく、結果的に定着数が少ないという課題があるため、実験進捗が遅れている。
Strategy for Future Research Activity	脂肪組織由来間葉系幹細胞の肺胞上皮細胞への分化を再現できていない点への対策としては、引き続き上記の三次元培養実験系を用いて、肺胞上皮細胞とAT-MSCの共培養モデルにおいてiPS細胞の2型肺胞上皮細胞への分化誘導に用いられるStepwise protocolを適応し、AT-MSCの肺胞上皮細胞への分化誘導を図っていく。 Muse細胞の肺胞上皮細胞への分化誘導実験についても同様に、上記の三次元培養実験系を用いて、Stepwise protocolを適応して肺胞上皮細胞への分化誘導を図っていく。Muse細胞が少ないことに関しては、培養技術が確立されていないことを鑑み、もとの培養細胞を大量培養するなどで対応していく。 AT-MSCもしくはMuse細胞による肺胞上皮細胞への分化を再現できたのちは、幹細胞の定着率の改善を可能とするニッチ環境の探索や、組織再構築を可能とする分化再生誘導因子の解明を進める。最終的には障害肺モデルにおける幹細胞投与を行って損傷修復や肺再生の効果について検証していく。一方で、AT-MSCやMuse細胞の肺胞上皮細胞への分化誘導を確認できなかった場合の対応としては、すでに2型肺胞上皮細胞への分化誘導法が確立されているiPS細胞を用いることとする。iPS幹細胞による肺再生治療の基礎実験として、これまでに確立してきた生体内の肺組織環境を模倣した三次元培養実験系を活用して、おもに幹細胞定着率の改善に寄与するニッチ環境の探索、定着後の組織再構築を促進する再生誘導因子の同定を進めていきたい。
Causes of Carryover	実験進捗の遅れにより、当初予定していたマウス線維化モデルにおけるAT-MSCの細胞治療実験を実施できなかったために、次年度使用額として25,338円が生じた。次年度において、2型肺胞上皮細胞への分化誘導に用いられるStepwise protocolの試薬や細胞培養関連の試薬などの物品費、ならびに研究成果の発表のための旅費や論文投稿費などに使用する予定である。