オピオイドへの耐性形成に関与するオピオイド受容体制御機構の解明

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K16446
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 清水 覚司 京都大学, 医学研究科, 助教 (80802793)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: オピオイド受容体 / 耐性形成 / Gタンパク質共役型受容体 / 翻訳後修飾 / アレスチン / 受容体内在化

Outline of Annual Research Achievements

前年度までに、ヒト神経芽細胞腫・SH-SY5Y細胞のゲノムDNAを編集し、μオピオイド受容体のN末端側にHAタグ配列を組み込んだ細胞株を樹立することに成功した。この細胞株を利用すれば、内在性に発現するμオピオイド受容体を、HA配列に対する抗体を利用して高い感度で検出したり、免疫沈降することが可能になる。そこで研究計画に沿い、質量分析法を利用して、リガンド刺激依存的にμオピオイド受容体に結合する分子群や、μオピオイド受容体がうける翻訳後修飾を網羅的に解析する実験を進めた。しかし、質量分析を行ったところ、μオピオイド受容体のペプチド断片は検出されるものの、結合分子群や翻訳後修飾様式を検出するには十分な感度を得ることができなかった。つまり、内在性の受容体は質量分析法による解析をするには発現量が少なすぎるという問題に直面した。本年度は１）ウイルスベクターを導入して過剰発現系を樹立し、まずは過剰発現系を用いて候補因子を同定すること、２）SH-SY5Y細胞を全トランスレチノイン酸及び脳由来神経栄養因子を利用して分化誘導すると、μオピオイド受容体の発現量が著増するという報告を参考にして、SH-SY5Y細胞を分化誘導する実験に取り組んだ。１）については、ウイルスベクターを利用した強制発現系を利用して、内在性の受容体と比して100倍近い発現量の細胞株を樹立することができた。また、２）については、種々の条件検討を行い、分化誘導によって受容体発現量が増強すること、リガンド刺激依存的な受容体内在化を再現性をもって検出できる実験系を樹立することができた。また、分化誘導を利用した実験系を利用して、オピオイド受容体をリガンドで長期刺激すると、細胞表面状に発現する受容体がDAMGOでは約60%程度、モルヒネでは約80%程度に減じることが明らかになった。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

本年度は、質量分析法により、μオピオイド受容体に結合する分子群や、受容体への翻訳後修飾様式の候補を抽出する予定であった。また、得られた候補因子に対して、分子生物学的な手法を用いて生理学的な意義を検証する研究を進める予定であった。しかし、初年度に細胞株を樹立する過程や質量分析法を利用した解析を行う過程で、想定しない問題に直面した。具体的には、ゲノムDNAを編集するにあたり、神経系細胞ではHEK293細胞などとは異なり、タグの種類によって受容体の発現量が影響を受けること、また、質量分析を用いた解析を行うには、生理的な発現量では必要十分でないことがわかった。今年度は、それぞれの問題を解決して研究を進めてきたが、当初予定と比較して１年ほど実験が遅れている。一方で、問題を解決する過程で、SH-SY5Y細胞を分化誘導して細胞分裂を抑制し、生理的な状態に非常に近い状態で解析を行う実験系を樹立することができた。予備的な実験として、２４時間から７２時間程度、持続的にリガンド刺激した状態での細胞膜上の受容体発現量の解析を行ったところ、受容体発現量は持続的に減少するが一定の発現量の状態を維持することが明らかになった。

Strategy for Future Research Activity

ウイルスベクターを利用して樹立した過剰発現系細胞を利用して質量分析法による解析を進める。当初予定していた動物実験までは解析が進まないかもしれないが、結合分子群や翻訳後修飾が受容体機能を制御する上で有している意義の解析を進める。さらに、研究計画の問題を解決する過程で、持続的にオピオイド刺激を受けた場合に、μオピオイド受容体発現量がどのように変化するかについての知見が蓄積しつつある。そのため、受容体の発現量や感受性がどのように維持されるのかという観点からも研究を進める。