2018 Fiscal Year Research-status Report
Mesenteric lymph exosomes are key mediators of post-trauma systemic inflammation
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18K16509
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| Research Institution | Tokyo Medical and Dental University |
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Principal Investigator |
小島 光暁 東京医科歯科大学, 医学部附属病院, 助教 (40815065)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 外傷出血性ショック / エクソソーム / 細胞外小胞 / 腸管虚血再灌流 / プロテオミクス |
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| Outline of Annual Research Achievements |
敗血症や出血性ショックの際には脳循環を維持するために腸管血流は著しく低下する。虚血腸管では様々な炎症性物質が産生され、それらは腸間膜リンパ管を介して遠隔臓器に伝播すると考えられている。しかし、炎症性物質の産生機序や運搬機構など、詳細な機序は明らかになっていない。申請者らは、腸間膜リンパ液中にエクソソームが存在することを証明し、これが全身性炎症反応症候群やショック後急性肺障害の発症に関与する可能性を見出した。エクソソームは、細胞から分泌される100nm程度の小胞であるが、病態により異なるタンパク質、核酸、脂質などを含有し、細胞間情報伝達に関与する。本研究では、腸管虚血再灌流後の腸間膜リンパ液中のエクソソームに内包される炎症性物質を同定し、ショック後臓器障害発現機序の解明を進める。具体的には、虚血再灌流モデル動物や培養細胞からエクソソームを分離し、それに含有される炎症物質を網羅的に解析したい。 今年度は、腸管虚血再灌流障害を模したin vitroで腸管上皮細胞を用いた低酸素/再酸素化モデルの作製と細胞培地からのエクソソーム分離手法の確立を行った。回収したエクソソームはタンパク質量分析(LC-MS/MS)に提出し、予備実験のサンプルの解析結果を得た。現在は、低酸素刺激によるエクソソーム内のタンパク発現変化を詳細に解析するとともに、追加サンプルを用意しつつ実験精度の向上を図っている。モデルの確立や、サンプル分離手法は順調に確立されており、次年度以降の解析の準備環境は整っている。よって、研究は概ね順調に進行していると考えられる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ラット虚血再灌流モデルを作製しの腸間膜リンパ液からエクソソームを分離して、フローサイトメトリーを用いて表面マーカーの解析を実施した。その結果、腸間膜リンパ液中に放出されるエクソソームは、EpCAMを高度に発現しており、主な産生元は腸管上皮細胞であることが示唆された。そこで、腸管上皮細胞を用いて、in vitroで虚血再灌流を再現すべく、低酸素/再酸素化の培養モデルを確立した。通常(21%)と低酸素(1%)環境で培養した腸管上皮細胞の培地からそれぞれエクソソームの分離を行った。エクソソームの分離には超遠心法、カラム法、市販の回収試薬を用いてそれぞれ回収効率の検討を行った。その結果、回収試薬で最も効率的にエクソソームの採取が可能であったため同方法を採用した。回収したエクソソームを用いて、LC-MS/MSによるタンパク質量分析行った。
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| Strategy for Future Research Activity |
タンパク解析では、エクソソーム中に５０００種類以上のタンパクが内包されていることが明らかになった。さらに、低酸素(1%)培養で回収したエクソソームは通常培養と比べその組成が大きく変化していることが分かった（添付資料）。現在、個々のタンパク同定及びシグナル解析を実施中である。また、同検体を用いて脂質解析の実施も可能となったため並行して行いたい。解析終了後に論文を作成予定である。
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| Causes of Carryover |
実験は概ね計画通り進行したが、次年度も引き続き細胞培養培地やエクソソーム分離試薬を引き続き購入する必要がり、12,916円の繰越しとした。
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Research Products
(4 results)
