2018 Fiscal Year Research-status Report

Elucidation multilateral pathology by analysis of respiratory tract microbiome of ARDS using next generation sequencing method

Research Project

Project/Area Number	18K16518
Research Institution	Hiroshima University
Principal Investigator	京道人広島大学, 病院(医), 助教 (90773937)
Project Period (FY)	2018-04-01 – 2021-03-31
Keywords	細菌叢 / ARDS
Outline of Annual Research Achievements	急性呼吸窮迫症候群(Acute Respiratory Distress Syndrome, ARDS)は, 致死的急性呼吸不全の代表例であり, その治療成績はいまだ十分ではなく病態も不明な点が多い. 気管支肺胞洗浄を用いた次世代シークエンス手法を利用したメタゲノム解析手法は, 末梢気道に存在する微量細菌叢を極めて高感度かつ網羅的に検出することができる新たな手法である. 本研究の目的は, (1)次世代シークエンス法及びメタゲノム解析を用いたARDS患者末梢気道に存在する微量細菌叢の解析, (2 )ARDS重症化予測における微量細菌叢の相関解析, (3)マウスモデルを用いた微量細菌叢によるARDS発病実験である. 本研究成果により, これまで未知であった微量細菌叢と生体の免疫学的応答性機序を明らかにすると共に, 新規治療法開発を目的とした標的分子同定の基礎的検討を行う. 平成30年度は、次世代シークエンス法及びメタゲノム解析を用いた ARDS患者末梢気道に存在する微量細菌叢の解析を行なった。 1. 人工呼吸中の ARDS 患者の血液, 肺胞洗浄液を採取し, 解析に用いるまで凍結保存した。 2. 肺胞洗浄液を用いて細菌のメタゲノム解析を行った。細菌の 16S rRNA 遺伝子内のV6 領域を標的としPCRを行い, 核酸の増幅を行った。それらのアンプリコンに, キットを用いて, 次世代シークエンシングを行い, 細菌の塩基配列を決定した。得られた塩基配列を既存のデータベース(NCBI Taxonomy DB, Genbank)と照合し, 検体中の細菌叢を解析した。また, 同時に肺胞洗浄液中の細菌量を real-time PCR により定量的に評価た。 3. 血清及び肺胞洗浄液中のサイトカイン測定を行なっている。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 収集した血液、肺胞洗浄液検体を用い、次世代シークエンスを行う手法を確立した。安定して各検体あたり、1万リード以上の解析が可能となり、細菌叢解析に移行可能と考えた。その上で、肺胞洗浄液中の細菌叢を解析した。同時に、肺胞洗浄液中の細菌量を、real-time PCRにより解析した。それらの細菌叢や各細菌量との相関を調べるため、血液や肺胞洗浄液中の各種サイトカインの測定を行っている。当初予定していた、肺胞洗浄液中のメタゲノム解析、real-time PCRによる細菌量同定を行っており、おおむね順調に進展している。
Strategy for Future Research Activity	血液や肺胞洗浄液中の各種サイトカインの測定を行い、ここまで解析し得た細菌叢や各細菌量と各種サイトカイン・予後との相関を検討していく。
Causes of Carryover	次世代シークエンスによる細菌叢解析のために予定していた助成金であったが、方法の確立が想定よりも少ない予備実験で可能となったため、次年度使用額が生じた。次年度は当初予定していた、測定するサイトカインの種類を少なく見積もっていたが、ARDSの重症度に関連するサイトカインは他にも多く存在するため、予定より多い種類のサイトカイン測定に使用させていただく。