2019 Fiscal Year Annual Research Report

MicroRNA derived from myeloid-derived suppressor cell might contribute to the pathogenesis concerning immunosuppression in sepsis

Research Project

Project/Area Number	18K16525
Research Institution	Kansai Medical University
Principal Investigator	西本浩太関西医科大学, 医学部, 助教 (30758850)
Project Period (FY)	2018-04-01 – 2020-03-31
Keywords	遺伝子治療 / 敗血症
Outline of Annual Research Achievements	去年度においては、他大学の動物実験施設において、LPS投与による敗血症ラットモデルを作成し比較的細胞が回収しやすいラットの腹腔内マクロファージを用いて、細胞内micorRNAの網羅的解析を行った。その一部の研究結果は、報告予定である。その後の実験プロトコールとして、研究協力者及び大学院生の協力のもと、引き続きLPS投与により敗血症ラットモデルを作成し、経時的な変化をコントロール群と比較観察した。ラットの腹腔内及び血液中から、CD11bc+His48+の骨髄性免疫抑制細胞（myeloid-derived suppressor cell、MDSC）をフローサイトメーターCell Sorterで回収し、small RNAを抽出した。次世代シーケンサーで解析するための最低濃度を満たすために、複数のラットからの細胞をまとめて抽出する必要があった。次世代高速シーケンサーを用いた包括的miRNAのプロファイリング　ライブラリ調整（Ion Total RNA-seqキットを使用）→　ビーズ調整（エマルジョンPCRを行い、DNA断片をビーズ上に増幅する。）→　シーケンシング（エマルジョンPCR後のサンプルをマイクロチップに注入しIon PGMシーケンサにて塩基配列を検出し、miRNAの発現定量を行う。）→　データ解析（Ion PGMシーケンサで選出したデータはTorrentサーバーに転送され、解析ソフト：Genomic Work Bench, CLCバイオ社を用いて解析する。）複数のmiRNAが、統計解析で有意に変化していた。特定miRNAの検出と定量　次世代シーケンサーにおいて発現変化していたmiRNAから選別した特定のmiRNAをReal-Time PCR法を用いて定量し、複数のmiRNAにおいて、有意に変化していることを確認した。研究結果の詳細については、研究成果報告書にて報告する。