2018 Fiscal Year Research-status Report
革新的受容体合成技術を利用した新規核酸医薬品（アナフィラキシー予防薬）の開発
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18K16541
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| Research Institution | Ehime University |
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Principal Investigator |
鈴木 康之 愛媛大学, 医学部, 研究員 (10745144)
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2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | アナフィラキシー / 周術期合併症 / アレルギー / Mas関連G蛋白質共役型受容体 / 麻酔関連薬 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
周術期の薬剤によるアレルギー反応は、時に致命的となり得るため、予防方法の確立が望まれる。従来より、IgE抗体を介するアレルギー反応が周術期のアナフィラキシーの原因と考えられていたが、抗生物質や筋弛緩薬により直接Mas関連G蛋白質共役型受容体 X2受容体(MRGPRX2)が刺激されヒスタミンを遊離するという報告が、新たな原因の一つと考えられるようになった。
しかしMRGPRX2に対する特異的な拮抗薬は存在しないため、拮抗薬を開発することで、薬剤によるアレルギー反応を予防することが可能になると考えた。また、開発する新規拮抗薬の候補として、抗体医薬品の代替として注目される、核酸医薬品であるDNAアプタマーを選択した。DNAアプタマーの選別に当たっては、無細胞蛋白質合成系用いて、人工脂質二重膜上にMRGPRX2を合成したものを鋳型としてSELEX法を行った。
MRGPRX2を発現させたラット好塩基球様細胞(MRGPRX2-RBL-2H3)を用いてスクリーニングを行い、最もMRGPRX2に結合するアプタマーを一つ選び出した。
現在、得られたアプタマーを用いて、MRGPRX2-RBL-2H3からのヒスタミン遊離抑制効果があるかどうかを確認中である。また同細胞をラットの皮下に埋め込んだ、アナフィラキシーモデルラットにおいても、新規アプタマーがアナフィラキシー予防効果を有していることを確認する予定である。また、薬剤投与をより簡便に行うために、アプタマーの安定化も検討していく。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
無細胞蛋白質合成系で人工脂質二重膜上に合成したMRGPRX2を鋳型として、SELEX法を行うことで新規アプタマーのより簡便に行うことが出来た。頻用されるCell-SELEX法は、培養細胞に発現させた目的蛋白質を鋳型として用いるために、細胞膜表面の様々な蛋白質に対して、非特異的にアプタマーが結合しやすいためnegative SELEXのステップでアプタマーを失いやすいデメリットがあった。また、目的蛋白質のみを精製して鋳型として用いる方法の場合も、ゲルなどの固定相に目的蛋白を固定し、SELEX法を行う必要があり、作業が繁雑であった。しかし、人工脂質二重膜上に合成したMRGPRX2は単純な遠心分離で単利が可能であり、SELEX法のステップを簡便になった。
得られた新規アプタマーは、MRGPRX2-RBL-2H3に特異的に結合し、また、ヒスタミン遊離経路を阻害することを確認している。
今後の、より遊離抑制反応のより詳細なデータを取得する予定である。また、アナフィラキシーモデルラット作成方法も確立しており、新規アプタマーを大量合成後に、生体でのアナフィラキシー予防効果を確認できる体制が整っている。
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| Strategy for Future Research Activity |
アナフィラキシーモデルラットを用いた、新規アプタマーの予防効果を評価する予定である。アプタマーは一般的に血中で容易に代謝されるため、当初はラットに移植する段階で、MRGPRX2-RBL-2H3と新規アプタマーを結合させて、評価を行う予定である。
効果が確認されれば、血中で安定するように、ポリエチレングリコールをアプタマーに加えるなどの修飾を行う予定である。また、in silicoでアプタマーの2次元構造を把握し、結合しやすいループ構造部分のみを選び出し、さらに結合しやすいDNAアプタマーを作成していく計画である。
並行して、周術期アナフィラキシー既往症例に関する後ろ向き検討を行っており、既往症例でのMRGPRX2遺伝子全長解析なども進めていき、MRGPRX2と周術期のアナフィラキシーの関係を明らかにしていく予定である。
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| Causes of Carryover |
残額は端数であり、予算内での研究を遂行した結果である。
次年度に繰り越すことで、研究をより良く遂行できると考える。
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