成長板軟骨損傷後の治癒過程におけるガングリオシドによる内軟骨性骨化制御機構の解明

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K16605
• Research Institution: Hokkaido University
• Principal Investigator: 松岡 正剛 北海道大学, 大学病院, 助教 (70816066)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: 成長板軟骨損傷 / ガングリオシド

Outline of Annual Research Achievements

2018年度に行った基礎実験により、マウスにおける成長板損傷モデルを確立した。本モデルは、25-G針によりマウス脛骨近位成長板に損傷を作製するものであるが、C57BL/6マウス雌3週齢を対象とし解析したところ、脛骨全長はSham手術を行った健側と比較して約4％低下し、臨床における骨端線障害を模倣するモデルとして使用できることが明らかとなった。現在、損傷後の骨橋形成の動向について組織学的検討、マイクロCTを用いた骨梁の解析を行っている。
本成果を元に成長板軟骨損傷後の糖脂質の果たす役割を調査するために、野生型マウス3－5日齢のEpiphyseal chondrocytesを回収し、グライコブロッティング法による網羅的糖鎖解析法を行ったところ、ガングリオシドシリーズの中でも特にGD3合成酵素で合成される糖脂質の一群であるb-seriesが約70％程度を占めることが明らかとなった。従って、当初予定していたGM3合成酵素ノックアウトマウスを用いた解析よりも、GD3合成酵素ノックアウトマウスを用いた解析を行った方が、よりSpecificで臨床応用に即した研究を行えるのではないかと着想した。
そこで、GD3合成酵素ノックアウトマウスのコロニーの構築を行い、2019年度は時間を要した。マウスコロニーの構築は終了し、現在解析を進めているが、GD3合成酵素ノックアウトマウスにおいて、成長障害が強くでる傾向を示している。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

網羅的糖鎖解析により当初想定していた糖脂質GM3ではなく、GD3が軟骨恒常性維持に重要な役割を果たしていることが明らかとなったため、GM3ノックアウトマウスではなく、GD3ノックアウトマウスを用いた解析を行う方向とした。このため、マウスコロニーの再構築が必要となり、進捗状況にやや遅れが生じた。
現在マウスコロニーの構築は終了し、GD3ノックアウトマウスを用いた解析を開始している。Preliminary dataではあるが、GD3ノックアウトマウスにおいて成長板軟骨損傷においてコントロールの野生型マウスと比較して、成長障害が強くでる傾向が見られており、本研究の妥当性を示しているものとして、本研究課題の延長を申請し研究を継続している。

Strategy for Future Research Activity

研究計画とこれまでの予備実験結果を踏まえて、GD3合成酵素欠損マウスを用いて成長板軟骨損傷の治癒過程において糖脂質の果たす役割を網羅的に解析する予定である。

Causes of Carryover

網羅的糖鎖解析により、当初予定していなかったGD3合成酵素ノックアウトマウスでの解析が必要と考えられたため、2019年度はマウスコロニー構築に時間を要し、結果としても研究費を要さなかったため、次年度に繰越が生じた。すでにマウスコロニーの構築は完了したため、2020年度はGD3合成酵素ノックアウトマウスを用いて、糖脂質が成長板損傷後の修復過程に与える影響をマイクロCT、組織学的解析などを用いて行う予定である。