2019 Fiscal Year Research-status Report
軟骨細胞のストレス応答におけるSIRT1の役割の解明
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18K16630
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| Research Institution | Kyoto Prefectural University of Medicine |
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Principal Investigator |
井上 裕章 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 学内講師 (60457968)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | Sirt1 / HSP70 / 軟骨代謝 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
Sirt1のHSP70を介した軟骨保護効果についてin vitroで検討した。6週齢雄性のwistar系ラットの肩関節、股関節、膝関節から軟骨組織を採取し、軟骨細胞を単離した。単離した軟骨細胞を単層培養し、resveratrolなどのSirt1賦活剤を用いてSirt1を賦活化した。各種賦活剤の細胞毒性を確認し適切な濃度を決定した後、刺激時間によるSirt1、HSP70およびanabolic factorの発現をrealtime PCR、Western blottingを用いて遺伝子レベル、タンパクレベルで検討した。結果、各種Sirt1賦活剤によってSirt1は遺伝子レベル、タンパクレベルで発現は亢進した。HSP70の発現は上昇傾向はあったが有意な変化は認めなかった。 aggrecan、col2の発現にも変化はなかった。siRNAを用いてSirt1の抑制実験を行ったが、HSP70の発現には影響を与えなかった。本実験では6週齢wistar系ラット 由来の軟骨細胞を使用しており、加齢によって発現が減少するSirt1のは影響が少ないのではないかと考えた。
そのため、Sirt1を搭載したplasmid vectorを開発し、軟骨細胞にtransfectionすることでSirt1を強制発現させ、SIRT1の発現をより上昇させた後に遺伝子の発現量を検討した。軟骨細胞へのtransfectionにはelectroporation法を用いてplasmidを導入しSirt1を一過性発現させた。transfection後の軟骨細胞ではHSF発現には変化がなかったが、Sirt1、HSP70の発現が優位に上昇していた。このことから軟骨細胞においてHSP70はSirt1発現量に依存して発現が変化することが明らかとなった。
今後、Sirt1とHSP70を賦活化した状態での軟骨保護効果を検討するために、過度な熱ストレスを加えた状態でのanabolic factorの発現や細胞毒性の評価を行う予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
Sirt1のplasmid vectorの作製、導入方法の検討に時間を要した。
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| Strategy for Future Research Activity |
軟骨細胞におけるSirt1の強制発現ではSirt1、HSP70の発現が優位に上昇していた。このことから軟骨細胞においてHSP70はSirt1発現量に依存して発現が変化することが明らかとなった。
今後、Sirt1とHSP70を賦活化した状態での軟骨保護効果を検討するために、Sirt1を導入した軟骨細胞に43°の過度な熱ストレスを加えることによる、anabolic factorの発現や細胞毒性の変化を、遺伝子レベル、タンパクレベルで検討する予定である。
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| Causes of Carryover |
Sirt1のplasmid作製、軟骨細胞への導入方法の検討に時間を要し、その後の研究役購入を先送りしているため。
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